Научная литература содержит достаточно данных о вреде физических нагрузок высокой интенсивности, в частности об их влиянии на биохимические процессы в различных органах [4; 6; 10; 11; 13], в том числе и почках [11]. Несмотря на это, наблюдается дефицит исследований, занимающихся выявлением особенностей сочетанного воздействия на организм человека чрезмерных физических нагрузок с другими факторами. Одним из таких факторов может быть острая интоксикация этанолом, так как злоупотреблению спиртными напитками не редко предшествует интенсивная физическая работа. В связи с этим актуальным является изучение физиологических процессов, происходящих в организме, и в органах выделительной системы в частности, при одновременном действии на него чрезмерных физических нагрузок и острой интоксикации этанолом.
Важным звеном метаболизма является антиоксидантная система. Она защищает клетки от свободных радикалов и продуктов перекисного окисления липидов и белков. Глутатионовая антиоксидантная система является составной частью антирадикальной и антиперекисной защиты клеток и состоит из ферментов, участвующих в редокс-цикле глутатиона, а также энзимов, использующих глутатион или образующие его аминокислоты для конъюгирования различных веществ.
Цель исследования: оценить состояние системы глутатиона в почках крыс, подвергнутых чрезмерным физическим нагрузкам в сочетании с острой алкогольной интоксикацией.
Материал и методы. Исследования проводились на кафедре биохимии Омского государственного медицинского университета в 2012–2015 гг. В качестве экспериментальных животных были использованы 79 белых крыс-самцов массой 180–200 г. Методом случайной выборки крыс делили на 6 групп: 1-ю группу составили интактные крысы (n=15); 2-ю группу – контрольные животные, которые плавали без груза по усредненному времени (3–5 мин.) (n=15); 3-ю – контрольные крысы, получавшие физиологический раствор вместо этанола (n=15); 4-ю – крысы, подвергнутые чрезмерным физическим нагрузкам по методу В.В. Корняковой с соавт., 2007 [5], плававшие с грузом 10% от массы тела до полного утомления (n=12); 5-ю – крысы, получавшие этанол (n=10); 6-ю – крысы, подвергнутые чрезмерным физическим нагрузкам в сочетании с острой алкогольной интоксикацией (n=12). Введение этанола крысам 5 и 6-й групп осуществлялось перорально при помощи металлического катетера в дозе 4 г/кг массы тела. При этом необходимо отметить, что крысы 6-й группы получали этанол после развития у них чрезмерных физических нагрузок. По истечении двух часов после введения этанола животных выводили из эксперимента. Температура воздуха в виварии составляла 19–21 °С, воды при плавании – 28–30 °С. При проведении эксперимента соблюдались требования Европейской конвенции по защите позвоночных животных, применяемых для экспериментальных и других научных целей 86/609 EEC.
После завершения эксперимента проводилось извлечение почек, которые позднее подвергались гомогенизации на 0,15 М растворе хлорида калия (KCl) в стеклянном гомогенизаторе Поттера при температуре 0–2 °С. В супернатанте гомогенатов определяли содержание общего белка при помощи биуретового реактива и глутатиона по Н.А. Костромитикову, Е.А. Суменкову, 2005 [7]. Данный метод основан на реакции восстановленного глутатиона с реактивом Эллмана, в результате которого образуется тионитрофенольный анион, и под его воздействием меняется цвет раствора, приобретая желтый оттенок. Активность глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) и глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) определяли по С.Н. Власовой с соавт., 1990 [2], глутатион-S-трансферазы (ГSТ, КФ 2.5.1.1.8) по Habig and Jakoby, 1981 [12] и гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ, КФ 2.3.2.2) по Persijn and van der Slik [14].
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0 фирмы StatSoft Inc. (США). Экспериментальные данные обрабатывали при помощи непараметрического U–критерия Манна–Уитни. Результаты представлены как Ме – медиана, Q1 – нижний квартиль, Q3 – верхний квартиль.
Результаты исследования и их обсуждение
Эксперимент показал, что изучаемые биохимические показатели у животных контрольных (2 и 3-й) групп не имеют статистически значимых различий по сравнению с интактными крысами. Чрезмерные физические нагрузки вызвали снижение концентрации глутатиона в почках крыс и изменение активности ферментов, участвующих в его метаболизме. Содержание глутатиона в почках животных 4-й группы снижено в 2,04 раза относительно аналогичного показателя во 2-й группе (табл. 1). Снижение концентрации трипептида у крыс с чрезмерными физическими нагрузками обусловлено развитием в почках острого нарушения метаболизма пуринов, сопряженного с усиленной генерацией активированных кислородных метаболитов (АКМ) в ксантиноксидазной реакции [11]. Острое нарушение метаболизма пуринов – это процесс, характеризующийся повреждением нуклеиновых кислот, нарушением энергетического обмена с последующим накоплением АМФ, запускающим процесс катаболизма пуриновых мононуклеотидов до урата [4; 6; 10]. Одним из негативных последствий острого нарушения метаболизма пуринов является активация ксантиноксидазы. Данный энзим активно генерирует АКМ, которые способны повреждать липиды, белки, а также нуклеиновые кислоты. Атака АКМ на липиды мембранных структур клетки приводит к накоплению в них продуктов перекисного окисления липидов.
Таблица 1
Изменение биохимических показателей в почках крыс, подвергнутых острой интоксикации этанолом на фоне чрезмерных физических нагрузок, Me (Q1–Q3)
|
Группа |
Показатель |
||
|
Глутатион, нмоль/мг белка |
Глутатионпероксидаза, МЕ/мг белка |
Глутатионредуктаза, МЕ/мг белка |
|
|
1-я n=15 |
14,9 (8,24–21,1) |
378 (271–489) |
288 (171–365) |
|
2-я n=15 |
15,7 (8,31–22,5) |
395 (282–476) |
258 (144–386) |
|
3-я n=15 |
15,1 (9,80–24,5) |
359 (263–475) |
270 (180–357) |
|
4-я n=12 |
7,30 (2,40–12,4) p[1]=0,00015 p[2]=0,00009 |
149 (87,6–206) p[1]=0,00001 p[2]=0,00001 |
93,8 (72,9–126) p[1]=0,00001 p[2]=0,00001 |
|
5-я n=10 |
19,2 (5,73–16,5) p[1]=0,01357 p[3]=0,00300 |
558 (432-723) p[1]=0,00018 p[3]=0,00028 |
345 (264–635) p[1]=0,01161 p[3]=0,00714 |
|
6-я n=12 |
5,90 (1,52–10,4) p[1]=0,00007 p[4]=0,17964 p[5]=0,01341 |
107 (60,3–161) p[1]=0,00001 p[4]=0,05704 p[5]=0,00009 |
70,9 (35,2–116) p[1]=0,00001 p[4]=0,02811 p[5]=0,00009 |
Примечание: (здесь и в табл. 2) p[1] – различия статистически значимы с 1-й группой; p[2] – со 2-й группой; p[3] – с 3-й группой; p[4] – с 4-й группой; p[5] – с 5-й группой.
Чрезмерные физические нагрузки у крыс 4-й группы вызвали снижение активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы на фоне активации глутатион-S-трансферазы и гамма-глутамилтрансферазы. Показатель глутатионпероксидазы в 2,65, а глутатионредуктазы в 2,75 раза ниже относительно аналогичного показателя 2-й группы (табл. 1). Снижение активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы может быть вызвано ингибированием ферментов продуктами реакции, а также меньшей стимуляцией экспрессии данных белков под влиянием антиоксидант-респонсивного элемента (ARE). Еще одной причиной снижения активности этих ферментов in vivo может быть дефицит селена [1; 8; 9].
Активность глутатион-S-трансферазы в почках крыс 4-й группы оказалась выше в 1,63 раза относительно аналогичного показателя 2 группы (табл. 2), что свидетельствует об интенсивном включении глутатион-S-трансферазы в процессы инактивации продуктов свободнорадикального окисления. Образовавшиеся глутатион-S-конъюгаты в результате реакции, катализируемой глутатион-S-трансферазой, подвергаются дальнейшему изменению под действием ряда ферментов, одним из которых является гамма-глутамилтрансфераза. Активность этого энзима у крыс 4-й группы была выше в 2,18 раза относительно аналогичных показателей 2-й группы.
Таблица 2
Изменение биохимических показателей в почках крыс, подвергнутых острой интоксикации этанолом на фоне чрезмерных физических нагрузок, Me (Q1–Q3)
|
Группа |
Показатель |
|
|
Глутатион-S-трансфераза, МЕ/г белка |
Гамма-глутамилтрансфераза, МЕ/мг белка |
|
|
1-я n=15 |
1,12 (0,76–1,97) |
430 (290–537) |
|
2-я n=15 |
1,05 (0,73–2,01) |
435 (289–536) |
|
3-я n=15 |
1,14 (0,79–1,83) |
429 (287–525) |
|
4-я n=12 |
1,71 (1,21–2,36) p[1]=0,00049 p[2]=0,00229 |
959 (764–1146) p[1]=0,00001 p[2]=0,00001 |
|
5-я n=10 |
1,59 (1,17–2,19) p[1]=0,01840 p[3]=0,00714 |
601 (434–839) p[1]=0,00107 p[3]=0,00118 |
|
6-я n=12 |
1,85 (1,55–2,47) p[1]=0,00007 p[4]=0,14892 p[5]=0,06021 |
1154 (947–1553) p[1]=0,00001 p[4]=0,00456 p[5]=0,00005 |
Острая интоксикация этанолом у крыс 5-й группы, так же как и чрезмерные физические нагрузки у крыс 4-й группы, приводит к снижению содержания глутатиона в почках. Уровень этого метаболита в гомогенатах почек крыс 5-й группы был в 1,27 раза ниже относительно аналогичного показателя в 3-й группе. Это может быть связано с интенсивным вовлечением данного трипептида в реакции конъюгации с продуктами свободно-радикального окисления, образующимися в результате действия острой алкогольной интоксикации. Источниками АКМ при острой интоксикации этанолом могут быть различные ферментативные реакции как с участием самого этанола, так и с участием ацетальдегида, образующегося из этого спирта под действием алкогольдегидрогеназы [3]. Кроме того, усиленное образование кетоновых тел из-за избытка ацетил-КоА и NADH приводит к развитию кетоацидоза, способствующего интенсификации процессов острого нарушения метаболизма пуринов.
Снижение уровня восстановленного глутатиона в почках животных, подвергнутых острой алкогольной интоксикации, сопровождается активацией глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, глутатион-S-трансферазы и гамма-глутамилтрансферазы. Активность глутатионпероксидазы 5-й группы в 1,55, а глутатионредуктазы в 1,28 раза превышает аналогичный показатель 3-й группы. Увеличение активности данных ферментов в этих условиях может быть обусловлено индукцией экспрессии данных ферментов под влиянием ARE. Активность глутатион-S-трансферазы в почках животных 5-й группы в 2,00 раза выше относительно аналогичного показателя 3-й группы. Активность гамма-глутамилтрансферазы у крыс 5-й группы оказалась выше в 1,4 раза в сравнении с аналогичным показателем 3-й группы.
Острая интоксикация этанолом на фоне чрезмерных физических нагрузок привела к более выраженным изменениям биохимических показателей. Содержание глутатиона в почках крыс 6-й группы ниже в 1,24 и 3,25 раза относительно аналогичного показателя в 4 и 5-й группах соответственно. Несмотря на то что введение этанола крысам 5-й группы способствовало увеличению активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, у крыс 6-й группы отмечается снижение этих показателей. Активность глутатионпероксидазы в почках животных 6-й группы ниже в 1,41 и 3,24 раза относительно аналогичного показателя в 4 и 5-й группах соответственно. Активность глутатионредуктазы снизилась в 5,23 и 4,06 раза в сравнении с аналогичным показателем в 4 и 5-й группах соответственно. Объяснить это можно тем, что на момент введения этанола животным у них уже отмечаются признаки угасания функции антиоксидантной системы, в частности ее глутатионового звена. Этиловый спирт в этих условиях только лишь усугубляет положение, внося дополнительное количество АКМ, образующихся в процессе его метаболизма. Также немаловажно то, что острая алкогольная интоксикация способствует снижению активности общих путей катаболизма [3], приводя тем самым к истощению запасов углеводов. Усиление анаэробного гликолиза также способствует интенсификации острого нарушения метаболизма пуринов.
Несмотря на снижение активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы в почках крыс 6-й группы, активность глутатион-S-трансферазы и гамма-глутамилтрансферазы в них остается самой высокой в сравнении со всеми группами. Значение показателя активности глутатион-S-трансферазы у крыс 6-й группы в 1,08 и 1,16 раза выше относительно аналогичного показателя в 4 и 5-й группах соответственно. Активность гамма-глутамилтрансферазы в 1,22 и 1,92 раза выше в сравнении с аналогичным показателем в 4 и 5-й группах соответственно. Данная особенность связана с тем, что накопившиеся при чрезмерных физических нагрузках продукты перекисного окисления липидов ингибируют активность энзимов глутатионового редокс-цикла и стимулируют активность глутатион-S-трансферазы и гамма-глутамилтрансферазы. Введение крысам этанола на фоне чрезмерных физических нагрузок вызывает еще большее подавление активности первых ферментов и значительное увеличение активности вторых.
Заключение
Острая интоксикация этанолом на фоне чрезмерных физических нагрузок приводит к падению уровня глутатиона в почках крыс, снижению активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы на фоне активации глутатион-S-трансферазы и гамма-глутамилтрансферазы.