Ранее проведенными нами исследованиями было показано, что у рабочих-буровиков, работающих на нефтепромыслах севера Сибири, существенно повышено число цитогенетически измененных лимфоцитов крови и буккальных эпителиоцитов, что мы связываем с мутагенным действием генотоксикантов углеводородного происхождения [4]. Установлено, что уровень цитогенетических нарушений у рабочих-буровиков был различен в зависимости от присутствия в их генотипе определенных вариантов аллелей генов фермента глутатион-S-трансферазы GSTM1 и GSTT1 [6,8]. Имеются исследования, в которых было показано, что внедрение некоторых микронутриентов в диету рабочих трудящихся на потенциально вредных производствах существенно снижает в их организме риск возникновения цитогенетических аномалий. При этом особое место занимает использование хорошо апробированного антимутагена − аскорбиновой кислоты [1,3,12,13]. Целью настоящей работы явилось использование витамина С для коррекции цитогенетической нестабильности у рабочих-буровиков, различающихся по генам фермента глутатион-S-трансферазы GSTM1 и GSTT1.

Материал и метод

Обследовано 194 рабочих-буровиков в возрасте 23–38 лет, работающих вахтовым методом на нефтепромыслах севера Томской и Тюменской областей. Каждый рабочий в утреннее время за завтраком на протяжении 20 дней получал через систему блока-питания 200 г кефира с добавленным 1 граммом аскорбиновой кислоты. Взятие биологического материала (соскоб слизистой полости рта) проводили дважды до (контроль) и после (опыт) 20-дневного окончания эксперимента с аскорбиновой кислотой. Все обследованные дали индивидуальное добровольное согласие на проведение настоящих исследований. У каждого человека цитогенетически анализировали не менее 1000 эпителиоцитов. Приготовление препаратов из клеток буккального эпителия полости рта человека, фиксация, окраска и критерии оценки цитогенетических нарушений в эпителиоцитах изложены нами ранее [7]. Кроме того, из клеток буккального эпителия выделяли ДНК реактивами и методом, разработанным компанией Prep Filer Automated Forensic DNA Extraction Kit (USA). При анализе генов GSTM1 и GSTT1 на наличие делеций использовали мультиплексную ПЦР. В амплификационную пробу вносили две пары праймеров, что давало возможность одновременно амплифицировать фрагменты каждого из указанных генов. Нормальные аллели генов характеризуются присутствием ПЦР-продуктов: для GSTM1 (гомозиготы GSTM1 +/+ и гетерозиготы GSTM1 +/0) для GSTT1 (гомозиготы GSTT1 +/+ и гетерозиготы GSTT1 +/0). Делеционные («нулевые») гомозиготные варианты (GSTM1 0/0 и GSTT1 0/0) выявлялись по отсутствию фрагментов GSTM1 и GSTT1. Для генов GSTM1 и GSTT1 генотип 0/0 означает отсутствие на электрофореграмме фрагмента, соответственно, и данный индивидуум гомозиготен по делеции. Значок "+" означает присутствие фрагмента и данный донор либо гетерозиготен, либо гомозиготен по отсутствию делеции в указанных генах. Проведено анкетирование обследованных рабочих, при этом учтены: возраст, стаж работы на нефтепромыслах, национальность, пристрастие к курению, алкоголю, отсутствие в течение года рентгеновского и других видов облучения и вирусных инфекций, способных повлиять на результаты цитогенетического анализа.

Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета статистических программ STATISTICA v.6.0. Частоты гаплотипов сцепленных локусов для гена GSTM1 рассчитывали в программе “The EH software program, Rockefeller University, NY”. Все количественные показатели исследования обрабатывали с применением корреляционного анализа по Спирмену и t-критерия Стьюдента для независимых выборок, поскольку тестирование закона распределения при помощи критерия Колмогорова – Смирнова не выявило отличий от нормального [2]. Различия сравниваемых результатов (X±m, где X – выборочное среднее арифметическое, m – ошибка среднего арифметического) считались достоверными при достигнутом уровне значимости p<0,05.

Результаты и обсуждение

Полученные данные свидетельствуют (таблица), что наблюдается четко выраженный полиморфизм в числе клеток с кариопатологическими изменениями в буккальном эпителии у рабочих-нефтяников в зависимости от наличия в их генотипе определенных аллелей генов фермента глутатион-S-трансферазы. Особенно существенно повышенным был уровень кариопатологических нарушений у рабочих имеющих сочетание гомозиготного нулевого генотипа одновременно по генам GSTM1 и GSTT1. Значимое повышенное число клеток с кариопатологическими изменениями было зарегистрировано также и для рабочих имеющих сочетание генов GSTM1 (0/0) и GSTT1(+) по сравнению с нормальной гомозиготой GSTM1(+)/GSTT1(+) и гетерозиготой GSTM1(+)/GSTT1(0/0). Имеются данные свидетельствующие о том, что нулевые генотипы по глутатион-S-трансфераз (GSTM1 и GSTT1) ассоциированы с более высоким уровнем цитогенетических аберраций [10,11]. Полученные нами результаты подтверждают это заключение в отношении нулевого генотипа GSTM1. Среди наблюдаемых аберраций наиболее часто наблюдались клетки с микроядрами и протрузиями, которые возможно отнести к истинным цитогенетическим аберрациям, поскольку они образуются в результате отставания в митозе ацентрических фрагментов и отдельных хромосом [7].

Эффекты добавления витамина С на частоту эпителиоцитов буккального эпителия с кариопатологическими изменениями у рабочих-нефтяников в связи с полиморфизмом генов глутатион-S-трансферазы GSTM1 и GSTT1 

Примечание. Значимые отличия показателей в опытной и контрольной группах отмечены звездочками, а между группами рабочих, содержащих в генотипе мутантные нулевые аллели и группой с нормальным генотипом GSTM1 (+)/GSTT1(+) отмечены чертой: одной – при Р<0,05; двумя – при P<0,01.

В некоторых группах рабочих, принимавших на протяжении 20 дней аскорбиновую кислоту в дозе 1 г в сутки, наблюдались по некоторым показателям значимые изменения. Частота клеток с микроядрами у рабочих, получавших витамин С и имеющих нулевой гомозиготный генотип по генам GSTM1 и GSTT1, снижалась в 2,1 раза (6,2±0,5 при 12,8±1,3 ‰ в контроле; p<0,01), протрузии типа «разбитое яйцо» в 2,1 (2,1±0,5 и 5,0±0,7 ‰; p<0,01) и типа «язык» в 2,6 раза (0,8±0,3 и 2,1±0,4 ‰; p<0,01). Иные закономерности отмечены в отношении кариопатологических изменений, характеризующих апоптотический процесс. Известно, что кариопикноз, кариорексис и кариолизис относятся к определенным этапам деструкции ядра и эти изменения характеризуют процесс распада хроматина при апоптозе [7]. У рабочих, получавших витамин С, и имеющих нулевые гомозиготы по генам GSTM1 и GSTT1 число клеток с кариопикнозом было значимо выше, чем в контрольной группе (p<0,05), то же возможно сказать и о частоте клеток с кариорексисом (p<0,05) и кариолизисом (p<0,05). Корреляционный анализ частоты клеток с микроядрами и показателями деструкции ядра свидетельствуют о наличии в буккальном эпителии у рабочих с генотипом GSTM1(0/0)/GSTT1(0/0) обратно пропорциональной связи с кариопикнозом (r=-0,56; p<0,05), с кариорексисом (r=-0,62; p<0,01) и кариолизисом (r=-0,75; p<0,01). Эти данные позволяют сделать вывод о том, что некоторая часть клеток с микроядрами устраняется за счет стимуляции апоптотических процессов. Имеется исследование, где показано, что витамин С способен стимулировать апоптоз [9]. Согласно полученным нами данным этот эффект наблюдается только у носителей нулевых аллелей гена GSTM1(0/0)/GSTT1(0/0). В остальных группах рабочих изменений в показателях деструкции ядра клеток буккального эпителия не наблюдались.

Как известно, крупные микроядра формируются в основном за счет отставших целых хромосом, а мелкие из ацентрических фрагментов [7]. Анализ размеров микроядер свидетельствует о том, что у рабочих, получавших витамин С, наблюдается в основном снижение числа мелких микроядер (диаметр меньше 3 мкм). Возможно, это может быть связано с ролью аскорбиновой кислоты в стимуляции эксцизионной репарации ДНК [3]. Антимутагенный эффект аскорбиновой кислоты может проявляться и в том, что она способна повышать активность лимфоцитов-киллеров, одной из функций которых является устранение из организма генетически дефектных клеток [5]. Следует также отметить, что имеются данные, свидетельствующие о неоднозначной роли аскорбиновой кислоты в устранении генетических повреждений, так как в некоторых условиях она может наоборот способствовать усилению мутационного процесса [9].

Заключение

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют, что у рабочих нефтяников, в диету которых был введен витамин С, наблюдается снижение числа клеток буккального эпителия с микроядрами. Особенно значительные кариопатологические изменения наблюдались у рабочих-буровиков, имеющих нулевые аллели генов GSTM1 и GSTT1. Показано, что у рабочих, получавших витамин С, имеющих в генотипе нулевой аллель гена GSTM1, наряду со снижением числа клеток с микроядрами и протрузиями значимо возрастает количество клеток с кариопикнозом, кариорексисом и кариолизисом, что является свидетельством об усилении в буккальном эпителии апоптотических процессов.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РГНФ № 06-15-10190 и РФФИ № 16-40-700149.