Среди тяжелых металлов (ТМ), не относящихся к необходимым питательным элементам, кадмий (Cd) и свинец (Рb) являются наиболее распространенными и опасными. Загрязнение окружающей среды этими металлами обусловлено сжиганием жидкого и твердого топлива, выбросами металлоплавильных производств, сточных вод и частым применением фосфорных удобрений [9].

Связываясь на поверхности клеток или проникая в них, Cd и Рb взаимодействуют с функциональными группами белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и других биологически активных соединений, нарушая их структуру [14]. Общим следствием токсичности ТМ, в том числе кадмия и свинца, в растительном организме является чрезмерное накопление активных форм кислорода (АФК), которые могут вызвать перекисное окисление липидов (ПОЛ), окисление белка, инактивацию ферментов, повреждение нуклеиновых кислот и др. [14]. Высшие растения выработали сложные системы антиоксидантной защиты клеток, важнейшим звеном которых являются антиокислительные ферменты – каталаза и пероксидаза. Сохранение активности этих ферментов в условиях воздействия ТМ ряд исследователей связывают с устойчивостью растений к данному виду стресса [9, 14].

В настоящее время одним из перспективных направлений по повышению устойчивости растений к действию различных стрессовых факторов является использование экологически чистых технологий, основанных на применении эндофитных штаммов Bacillus subtilis, обладающих фунгицидной и ростстимулирующей активностями [6]. Бациллы продуцируют большое количество биологически активных веществ, таких как ферменты, в том числе антиоксидантные, антибиотики, различные аминокислоты [8]. Известен антистрессовый эффект B. subtilis (например, штаммы 26Д и 11ВМ) при воздействии на растения различных абиотических факторов (засоление, водный дефицит, действие ТМ) [2, 4-8, 13]. В литературе, однако, отсутствуют сведения о механизмах антистрессового эффекта этих бактерий, в том числе и при воздействии на растения ТМ. В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение влияния инокуляции семян пшеницы эндофитным штаммом B. subtilis 26Д на рост и активность антиоксидантных ферментов растений пшеницы в условиях совместного воздействия кадмия и свинца.

Материалы и методы

Растительный материал. Исследования проводили на растениях пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Омская-35). Перед проращиванием семена пшеницы калибровали, промывали в мыльной воде, ополаскивали, стерилизовали 96%-ным этанолом в течение 3 мин, затем трижды ополаскивали в дистиллированной воде.

Для обработки семян использовали бактерии Bacillus subtilis Cohn штамм 26Д, (деп. в коллекции ВНИИСХМ, № 128). Семена инокулировали бактериями из расчета на 1 г 20 мкл суспензии клеток с титром 1 млрд./мл.

Инокулированные и контрольные семена выращивали в вегетационных сосудах (15×15 см) на черноземе выщелоченном при температуре 18–20°С при равномерном освещении в лабораторных условиях. Металлы в почву вносили в виде растворов солей (Cd(NO₃)₂·4H₂O и/или Pb(NO₃)₂) однократно после посева семян, концентрации готовили в пересчете на ионы металлов. Контрольные растения поливали дистиллированной водой. Измерение растений и отбор проб проводили на 30 сут. эксперимента.

Получение экстрактов из растительных тканей. Побеги растений, выращенных в почве с различной концентрацией ионов металлов, промывали в дистиллированной воде, удаляли избыток воды фильтровальной бумагой, взвешивали. Растительный материал гомогенизировали в 0,1М К-фосфатном буфере pH 6,0 (при определении пероксидазы) или в Трис буфере pH 7,8 (при определении каталазы и малонового альдегида) в соотношении навеска (г): экстрагент (мл) – 1:10, центрифугировали 10 минут при 8 тыс. об./мин. Надосадочную жидкость центрифугировали еще 10 минут при 16 тыс. об./мин. Надосадок использовали для определения активности ферментов и малонового диальдегида (МДА) [3, 11, 12].

Определение активности ферментов и малонового диальдегида. Активность пероксидазы оценивали согласно методике Хайруллина с соавторами, исходя из количества окисленного ортофенилендиамина [11]. Активность каталазы определяли согласно методике Королюк с соавторами. Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс [3]. Содержание МДА измеряли, используя метод Costa с соавторами, основанный на образовании окрашенного комплекса между МДА и тиобарбитуровой кислотой при нагревании [12]. Измерение оптической плотности окрашенных растворов проводили на спектрофотометре Unico 2800 (США).

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью стандартных программ пакета Microsoft Office, данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Все эксперименты проводили в трех биологических повторностях. Достоверность различий между средними определяли по критерию Стьюдента при уровне значимости p < 0.05.

Результаты и их обсуждение

Влияние ионов ТМ на длину побегов пшеницы. В чистой почве показатели длины побегов, семена которых были инокулированы клетками бактерий, на 30-е сутки эксперимента были больше, чем у контрольных (необработанных) на 12% (табл. 1).

Ростстимулирующий эффект эндофитного штамма B. subtilis 26Д на растения на незагрязненных почвах связан, вероятно, со способностью этих микроорганизмов продуцировать различные биологически активные вещества, фитогормоны, улучшать минеральное питание растений [2, 8].

При наличии кадмия в почве (во всех исследованных концентрациях) наблюдали угнетение роста побегов необработанных растений пшеницы. Свинец, напротив, оказывал стимулирующее действие на рост побегов. Свинец в концентрациях 10 и 1500 мг/кг почвы стимулировал рост побегов необработанных бактериями растений на 1,2 и  11% по сравнению с проростками, растущими в чистой почве. При совместном действии кадмия и свинца угнетения побегов также не наблюдали. Стимулирующий эффект совместного действия ТМ усиливался с увеличением концентрации кадмия и свинца в среде выращивания.

Инокуляция семян клетками бактерий способствовала лучшему росту растений пшеницы в почве, как при совместном действии металлов, так и при раздельном. При воздействии ионов кадмия в концентрациях 10 и 200 мг/кг почвы рост инокулированных растений был выше на 17 %, чем у неинокулированных при тех же концентрациях металла. Длина побегов инокулированных растений при действии свинца  в концентрациях 10 и 1500 мг/кг почвы была больше на 13,5 и 12 %, чем у неинокулированных при тех же концентрациях металла. При совместном действии металлов в исследованных концентрациях рост инокулированных растений был выше на 5,8 и 3,3 %, чем у неинокулированных при низких и высоких концентрациях металлов, соответственно.

Таблица 1

Изменение длины побегов Triticum aestivum L. (см) под влиянием эндофитных бактерий и ТМ

* обозначены достоверные отличия между показателями обработанных и необработанных бактериями растений при p < 0.05.

Влияние ионов кадмия и свинца на активность антиоксидантных ферментов и содержание МДА в побегах растений. У растений, обработанных бактериями и растущих в незагрязненной почве, активность ферментов антиоксидантной защиты была выше, чем у необработанных на 22% и 15,5%, для каталазы и пероксидазы соответственно (табл. 2).

Известно, что ионы ТМ индуцируют образование АФК и могут вызывать значительные отклонения в метаболизме клеток, что, несомненно, отражается на активности антиоксидантных ферментов [14]. В нашей работе выявлено повышение активности каталазы и пероксидазы в побегах контрольных растений, растущих в почве, содержащей кадмий или свинец. Активность исследованных ферментов была выше у инокулированных бактериями растений, исключение составила активность каталазы в тканях растений, обработанных бактериями, выращенных при концентрации свинца 1500 мг/кг почвы. При воздействии ионов кадмия активности ферментов инокулированных растений при концентрациях металлов 10 и 200 мг/кг почвы была выше на 30-33% и 16,8 и 80,2% соответственно для каталазы и пероксидазы, чем у неинокулированных при тех же концентрациях металла. Активность пероксидазы инокулированных растений при действии свинца в концентрациях 10 и 1500 мг/кг почвы была больше на 7 и 5,1%, чем у неинокулированных при тех же концентрациях металла.

Совместное действие ТМ на растения приводило к падению активности каталазы (в 4,5 раза) и повышению активности пероксидазы. Бактеризация семян не изменяла эту тенденцию, но активность ферментов в тканях инокулированных растений в большинстве вариантов опыта была выше, чем у необработанных проростков. Активность каталазы инокулированных растений была выше на 3,5 и 2,5%, а активность пероксидазы была выше на 14,5 и 31,8%, чем у неинокулированных при низких и высоких концентрациях металлов, соответственно.

Таблица 2

Влияние эндофитов и ТМ на активность антиоксидантных ферментов  в побегах пшеницы

* обозначены достоверные отличия между показателями обработанных и необработанных бактериями растений при p < 0.05. 

Окислительный стресс, индуцированный кадмием и/или свинцом, в растениях пшеницы, вероятно, гасился повышением активности каталазы и пероксидазы [14], уровень которых при токсическом действии ТМ был выше в бактеризованных растениях по сравнению с контрольными. Не исключено, что вклад в общую активность этих ферментов может вносить и бактериальная каталаза, так как согласно паспорту исследуемого штамма он способен ее продуцировать.

Одной из основных мишеней действия АФК являются липиды – основные компоненты клеточных мембран. АФК способны инициировать их перекисное окисление, в результате чего происходит повреждение этих структур, связанное с нарушением функций мембранных белков [9, 15]. Уровень МДА у растений, семена которых обрабатывались бактериями, как при выращивании в незагрязненной почве, так и в присутствии кадмия и свинца, а также при совместном действии ТМ был ниже необработанных, т.е. бактеризация семян способствовала, вероятно, сохранению целостности мембранных структур растительных клеток. Меньшее содержание продуктов ПОЛ в побегах пшеницы при действии ТМ может свидетельствовать об эффективной работе описанных выше ферментов.

Таблица 3

Концентрация малонового диальдегида в тканях побегов пшеницы, 10^-5 нмоль/г сырого веса

* обозначены достоверные отличия между показателями обработанных и необработанных бактериями растений при p < 0.05.

Таким образом, повышение эндофитным штаммом бактерий B. subtilis 26Д устойчивости растений пшеницы к токсическому действию ТМ можно объяснить увеличением под влиянием этих микроорганизмов активности антиокислительных ферментов каталазы и пероксидазы в растительных тканях, сдерживающих развитие окислительного стресса, что  проявлялось в уменьшении продуктов ПОЛ.