Изучение связи общего холестерина (ОХ), как важнейшего показателя липидного обмена, с полиморфизмами генов имеет значимый прогностический эффект. Оценка риска и расчет предрасположенности к высокому холестерину позволит повысить эффективность ранней профилактики и терапии. Одним из наиболее многообещающих генов-кандидатов является ген гидрокси-метилглютарил-КоА-редуктазы - один из ключевых ферментов, регулирующих синтез ХС в печени на этапе превращения 3-гидрокси-3-метилглютарил коэнзима А (ГМГ-КоА) в мевалоновую кислоту путем двухступенчатого восстановления за счет NADH. Полиморфные варианты гена HMGCR могут влиять на метаболизм и транспорт липопротеидов плазмы и эффективность терапии статинами. Данный ген локализован на хромосоме 5 в области q13.3-q14.3, состоит из 20 экзонов, кодирует белок, состоящий из 888 аминокислот, который широко экспрессируется по всему телу.
Исследования, проведенные в различных популяциях [2; 3; 7], доказали наличие связи между некоторыми вариантами полиморфизмов гена HMGCR и липидным профилем, а также ассоциации между определенными вариантами полиморфизмов и повышенным риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, и эффективностью их медикаментозной терапии.
Цель настоящего исследования заключалась в анализе ассоциации полиморфного варианта rs3846663 гена HMGCR с повышенным уровнем холестерина. Данный полиморфный маркер расположен в интроне 18 и обусловлен нуклеотидной заменой С на Т. Этот полиморфизм еще малоизучен, вследствие чего его распространенность и ассоциации с уровнем общего холестерина (ОХ) представляют особый интерес. Полученные нами данные позволяют сделать вполне обоснованный вывод об ассоциации гена HMGCR с уровнем общего холестерина.
Материалы и методы исследования
Для проведения исследования было получено разрешение локального этического комитета при ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также добровольное информированное согласие пациентов на участие в исследовании.
Для изучения оценки распространенности и ассоциации полиморфизма rs3846663 гена HMGCR была обследована группа пациентов, состоящая из относительно здоровых лиц в количестве 173 человек (105 женщин, 68 мужчин), проживающих в городе Красноярске. Средний возраст составлял 49,98±0,49 года. Критериями включения для данной группы являлись: возраст – от 40 до 65 лет, пол – мужчины и женщины, отсутствие ИБС, отсутствие острых заболеваний и хронических заболеваний в момент обострения, отсутствие тяжелых хронических заболеваний. Критериями исключения являлись: наличие ИБС, острые заболевания, хронические заболевания в стадии обострения, наличие сахарного диабета, нарушения липидного обмена, тяжелые нарушения функции печени и почек, артериальная гипертензия.
Первоначально определялся спектр липидов, что включало определение концентрации общего холестерола, ТГ, ХС-ЛПВП, ХС-ЛПНП, ХС-ЛПОНП. Вышеперечисленные показатели определялись автоматически колориметрическим методом на приборе COBAS INTEGRA 400 plus (США).
Для генетического анализа использовался образец ДНК, выделенный из венозной крови пациента при помощи стандартного фенол-хлороформного метода. Для проведения последующих этапов молекулярно-генетических исследований использовался специальный набор реагентов для идентификации однонуклеотидных полиморфизмов (ООО НПФ «ЛИТЕХ»). Согласно инструкции последовательно проводили реакции амплификации, дефосфорилирования и мини-секвенирования для дальнейшей идентификации полиморфизмов на времяпролетном MALDI-TOF масс-спектрометре autoflex IV (Bruker Daltonics, Германия).
Для расчёта соответствия распределения генотипов в популяционной выборке закону Харди-Вайнберга использовали программное обеспечение Hardy-Weinberg equilibrium calculator. При обработке полученного материала применялись методы вариационной статистики (программное обеспечение IBM SPSS Statistics 20).
Результаты и обсуждение
В группе из 173 человек носителями гомозиготного генотипа СС полиморфизма rs3846663 гена HMGCR было 45 человек (26%), гетерозиготного генотипа СТ – 91 человек (52%) и патологической гомозиготы ТТ – 37 человек (21%). Частота встречаемости аллеля С составила 0,52, а аллеля Т – 0,48. Распределения частот генотипов полиморфизма rs3846663 гена HMGCR соответствовали популяционному равновесию Харди-Вайнберга, о чем свидетельствует значение χ2, равное 0,5 (табл. 1).
Таблица 1
Соответствие частот аллелей полиморфизма rs3846663 гена HMGCR равновесию
Харди-Вайнберга в группе относительно здоровых людей.
|
Генотип |
Наблюдаемая частота, % |
Ожидаемая частота, % |
χ2 (df=2) |
P |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
СС |
26,0 |
27,3 |
0,5 |
0,4 |
|
СТ |
52,6 |
49,8 |
||
|
ТТ |
21,4 |
22,7 |
Примечание. Здесь и далее: df = 2 - степень свободы для анализа частот генотипов, χ2 – хи-квадрат, P – уровень значимости различий (уровень соответствия равновесию Харди-Вайнберга).
Анализ частот генотипов полиморфизма rs3846663 гена HMGCR показал, что преобладают гетерозиготные носители данного полиморфизма.
Для исследования зависимостей между уровнями холестерина и генотипами полиморфизма rs3846663 исследуемая группа была «ранжирована» по нормам общего холестерина согласно российским рекомендациям (общепопуляционная норма ≤5,5 мМ/л, 5-й пересмотр, 2012 год) (1). Далее в исследовании использовались два обозначения уровня общего холестерина: нормальный (≤5,5 мМ/л) и повышенный уровень (>5,5 мМ/л).
С нормальным гомозиготным генотипом СС и нормальным уровнем ОХ было 75,6% (34 человека), с повышенным – 24,4% (11 человек). С гетерозиготным генотипом всего был 91 человек, из них только 37,4% (34 человека) с нормальным уровнем, а 62,6% (57 человек) с повышенным. Носителями патологического генотипа были 37 человек, из них 27% (10 человек) с нормальным уровнем ОХ и 73% (27 человек) с повышенным.
Итого, с мутантным аллелем Т было 128 человек – 34,4% (44 человека) с нормальным уровнем ОХ и 65,6% (84 человека) с повышенным.
Различия в этих трех группах были достоверными, данные представлены в таблице 2.
Таблица 2
Распределение по нормам общепопуляционного холестерина в зависимости от генотипов полиморфизма rs3846663
|
Показатель |
ОХ |
Общее количество пациентов |
p |
||||
|
Нормальный уровень |
Повышенный уровень |
||||||
|
абс. |
% |
абс. |
% |
||||
|
Генотипы |
СС |
25 |
55,6% |
20 |
44,4% |
45 |
|
|
СТ |
32 |
35,2% |
59 |
64,8% |
91 |
0,023 |
|
|
ТТ |
10 |
27,0% |
27 |
73,0% |
37 |
0,009 |
|
|
CT+TT |
42 |
32,8% |
86 |
67,2% |
128 |
0,007 |
|
Примечание: p - асимптотическая значимость.
При анализе данных о носительстве генотипа СТ была выявлена зависимость между носительством гетерозиготного генотипа и уровнем холестерина и, соответственно, предрасположенность лиц с генотипом СТ к повышенному уровню холестерина. Расчет относительного риска показал, что вероятность повышенного уровня общего холестерина у носителей генотипа СТ в 1,3 раза выше (95%C.I. 1.02-1.73), чем у людей с гомозиготным генотипом СС. При этом отношение шансов равно 2,30 (95%C.I. 1,11-4,77).
При проведении анализа на поиск отличий между носительством генотипов СС и ТТ мы также получили данные о существовании зависимости между носительством мутантного генотипа и уровнем холестерина и, как следствие, предрасположенности лиц с генотипом ТТ к повышенному уровню холестерина. Расчет относительного риска показал, что вероятность повышенного уровня общего холестерина у носителей генотипа ТТ в 2,01 раза выше (95%C.I. 1.12-3.58), чем у людей с гомозиготным генотипом СС. При этом отношение шансов равно 3,37 (95%C.I. 1,32-8,58).
Также была найдена зависимость между носительством аллеля Т и повышенным общепопуляционным уровнем холестерина. Расчет относительного риска показал, что вероятность повышенного уровня общего холестерина у носителей аллеля Т в 1,3 раза выше (95%C.I. 1.05-1.59), чем у людей с гомозиготным генотипом СС. При этом отношение шансов равно 2,56 (95%C.I. 1,27-5,12).
При проведении анализа внутри групп, сформированных по половому признаку, отличия были найдены только в группе женщин. Данные представлены в таблице 3.
Таблица 3
Распределение по нормам общепопуляционного холестерина среди женщин в зависимости от генотипов полиморфизма rs3846663
|
Показатель |
ОХ |
Общее количество пациентов |
p |
||||
|
Нормальный уровень |
Повышенный уровень |
||||||
|
абс. |
% |
абс. |
% |
||||
|
Генотипы |
СС |
21 |
65,6% |
11 |
34,4% |
32 |
|
|
СТ |
19 |
35,2% |
35 |
64,8% |
54 |
0,006 |
|
|
ТТ |
5 |
26,3% |
14 |
73,7% |
19 |
0,009 |
|
|
CT+TT |
24 |
32,9% |
49 |
67,1% |
73 |
0,002 |
|
Примечание: p - асимптотическая значимость.
При расчете относительного риска было выявлено, что при генотипе СТ у женщин вероятность повышенного уровня общего холестерина в 1,8 раза выше (95%C.I. 1,20-2,89), чем у женщин с генотипом СС. Отношение шансов равно 3,51 (95%C.I. 1,40-8,81).
В то же время у женщин - носительниц генотипа ТТ вероятность повышенного уровня общего холестерина в 2,49 раза выше (95%C.I. 1,12-5,51) в сравнении с носительницами генотипа СС. Отношение шансов при этом составляло 5,34 (95%C.I. 1.52-18.75).
У женщин при носительстве аллеля Т вероятность повышенного уровня общего холестерина в 1,99 раза выше (95%C.I. 1,32-3,01) в сравнении с носительницами генотипа СС. Отношение шансов при этом составляло 3,89 (95%C.I. 1.62-9.37).
Заключение
Носительство полиморфных аллелей генов, кодирующих фермент 3-гидрокси-3-метилглютарил-кофермент А редуктазу, может существенно влиять на предрасположенность к повышенному уровню холестерина.
В нашем исследовании выявлена корреляционная зависимость между полиморфизмом rs3846663 гена HMGCR и уровнем общего холестерина относительно общепопуляционных норм. У носителей генотипа СT риск повышения холестерина относительно общепопуляционных в 1,3 раза выше, чем у носителей СС генотипа. У женщин риск повышенного уровня холестерина выше в 1,8 раза. У носителей генотипа ТТ риск повышения холестерина относительно общепопуляционных норм выше в 2 раза, а у женщин в 2,49. У носителей аллеля Т риск повышения холестерина относительно общепопуляционных норм в 1,3 раза выше по сравнению с носителями СС генотипа. В группе женщин при аллеле Т риск повышенного уровня холестерина выше в 1,99 раза.
Все участники исследования подписывали информированное согласие. Протокол исследования соответствовал этическим принципам и нормам проведения биомедицинских исследований. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом (выписка из протокола № 41/2012 заседания локального этического комитета ГБОУ ВПО «КрасГМУ», заседание состоялось 21.06.2012).