Рядом исследователей было установлено, что участие хондроцитов в продукции белковых и полисахаридных веществ осуществляется согласно принципу преимущественного приспособления клетки к синтезу определенного вещества, или белка, или полисахарида [5]. Эта функциональная адаптация находит свое отражение в морфологии хондроцитов. В частности, хондроциты I типа содержат умеренное количество митохондрий, небольшой комплекс Гольджи и значительное количество эргастоплазмы с многочисленными цистернами, заполненными электронноплотным веществом в виде гранул и волоконец, которые идентифицируются как тропоколлаген. Хондроциты II типа характеризуются отдельными узкими каналами эргастоплазмы без расширений, небольшим количеством митохондрий и хорошо развитой системой элементов комплекса Гольджи. В их цитоплазме всегда обнаруживаются обширные области, содержащие хлопьевидные электроннопрозрачные вещества, которые отождествляются с полисахаридами.
Было также установлено, что взаимодействие между коллагеном и гликозамингликанами зависит от рH, ионного состава, ионной силы среды и по природе является электростатическим. Вследствие этого гликозамингликаны оказывают влияние как на фазы фибриллогенеза коллагена, так и на образование на фибриллах центров минерализации [6].
Однако следует отметить, что, несмотря на значительное количество фактов о биосинтезе протеогликанов и гликозамингликанов, подавляющее большинство из них получено на материале от низших млекопитающих и птиц. В доступной литературе отсутствует также комплексное исследование локализации, динамики накопления и изменения спектра протеогликанов и гликозамингликанов на стадиях пренатального морфогенеза трубчатых костей человека, к которым относятся бедренные кости, в регионах с резко различающимся набором микроэлементов в окружающей среде.
В связи с этим целью исследования явилось сравнительное изучение изменений содержания и спектра гликозамингликанов в закладках бедренных костей человека при пери- и энхадральном остеогенезе в различных геохимических условиях.
Материал и методы исследования
Материалом исследования служили бедренные кости и их закладки 47 зародышей и предплодов женского пола, полученных в результате искусственного прерывания беременности у практически здоровых женщин, и преждевременных родов, обусловленных экзогенным воздействием, из прозектур, акушерских и гинекологических клиник г. Астрахани и г. Махачкалы в осенне-зимний период.
Для электронномикроскопического исследования локализации гликозамингликанов ультратонкие срезы контрастировали на сетках 0,5 % раствором нитрата висмута [7].
Содержание гликозамингликанов в закладках бедренных костей оценивали визуально под световым микроскопом в баллах [3].
С целью выявления сульфатированных гликозамингликанов парафиновые срезы толщиной 5–7 мкм обрабатывались 0,5 % раствором коричневого основного [4].
Разделение исследуемых гликозамингликанов по степени кислотности, в значительной степени зависящей от количества сульфогрупп, достигалось применением окраски 0,5 % раствором толуидинового синего при различных кислых значениях рH мединал-ацетатного буфера, применяемого в качестве растворителя краски. При рH = 2,62 выявлялись кислые высокосульфатированные гликозамингликаны, а при рН = 6,12 – менее кислые, низко сульфатированные вещества этой группы [2].
Количественные данные, полученные в ходе выполнения исследования, проанализированы методами вариационной статистики и определения достоверности различий с использованием утилиты OpenOffice Calc из свободно распространяемого программного продукта OpenOffice.
Результаты исследования и их обсуждение
На всех рассматриваемых стадиях остеогенеза (6–12 недели внутриутробного развития) наиболее интенсивный синтез гликозамингликанов происходит в хондроцитах зоны роста метаэпифизарного хряща закладок бедренной кости; они хорошо локализуются в эндоплазматической сети и комплексе Гольджи (Рис.1). В зонах гипертрофии и дегенерации наблюдалось меньшее число хондроцитов с признаками синтеза полисахаридной части матрикса хряща, что характерно и для Астрахани, и для Махачкалы. Межклеточное пространство зон гипертрофии и дегенерации метаэпифизарного хряща содержат гликозамингликаны в виде составе электронноплотных везикул матрикса разной величины, в среднем 12,0 ± 2,3 нм, которые или связаны с волокнами коллагена, или располагаются в межклеточном пространстве свободно.
Рис. 1. Интенсивное контрастирование мембран эндоплазматической сети и комплекса Гольджи в хондроцитах зоны роста метаэпифизарного хряща закладки бедренной кости предплода человека 9 недель из г. Махачкалы. Обработка препарата по Смиту-Серафини-Фракассини. Ув.х 10000
Гистохимическое исследование качественного состава и динамики накопления гликозамингликанов с использованием специфических топооптических реакций показало, что на ранних стадиях остеогенеза у человека (6–8 недель внутриутробного развития) в изучаемых геохимических регионах в хрящевых закладках бедренных костей гликозамингликаны представлены в основном несульфатированными соединениями. Подтверждением тому является красно-фиолетовое (В-метахроматическое) окрашивание на 2 балла толуидиновым синим с рН 6,12 гистологических препаратов хрящевых закладок и светло-желтое их окрашивание на 1 балл основным коричневым.
Относительно невелико содержание хондроитинсульфата, о чем свидетельствует слабо положительная реакция на 2 балла в территориальном матриксе эмбрионального хряща закладок при обработке срезов 0,4 М раствором хлористого магния с альциановым синим, тогда как применение красящего раствора с 0,9 М хлористым магнием приводило к бледно-голубому окрашиванию (0, 1 балл).
Таким образом, представляется весьма вероятным, что хондроитинсульфат в многоклеточном веществе хрящевых закладок бедренных костей человека 6–8 недель внутриутробного развития и в г. Астрахани, и в г. Махачкале представлен слабо сульфатированными формами и локализуются в основном в территориальном матриксе.
Количество креатинсульфата минимально и в территориальном и в межтерриториальном матриксе. В зонах роста и гипертрофии метаэпифизарного хряща закладок бедренных костей на 9,10 неделях пренатального развития отмечается яркое красно-фиолетовое окрашивание межклеточного вещества хряща (3 балла) толуидиновым синим при рH буферного раствора 6,12; диффузное бледное красно-фиолетовое при рН 2,62 (2 балла) (Рис.2).
Реакция с коричневым основным приводит к развитию в этих зонах насыщенного желтого окрашивания на 2 балла матрикса хряща.
Суммарная гистохимическая реакция на хондритинсульфат и кератансульфат дает ярко-голубое окрашивание (3 балла) особенно в межтерриториальном матриксе хряща зоны гипертрофии.
Следовательно, локализация и выраженность гистохимических реакций позволяют заключить, что в зоне роста и гипертрофии костных закладок 9, 10 недель нарастает количество кислых гликозамингликанов, представленных в основном хондритинсульфатами со средней степенью сульфатированности. На данных стадиях онтогенеза количество кератансульфата увеличивается в межтерриториальном матриксе зоны гипертрофии хрящевых закладок, особенно в г. Махачкале.
Рис.2. Метахроматическое окрашивание тулуидиновым синим (pH 2,62) межклеточного вещества зоны гипертрофии метаэпифизарного хряща закладки бедренной кости предплода человека 9 недель пренатального развития из г. Астрахани. Окраска по Пирсу. Об. 10, ок. 10
На стадиях 9,10 недель внутриутробного развития обработка срезов раствором коричневого основного по Шубичу приводит к окрашиванию в закладке кости межклеточного вещества зоны дегенерации в желто-коричневый цвет (3 балла). Окраска альциановым синим суммарна на хондроитинсульфат и кератансульфат вызывает яро-голубое окрашивание (3 балла) межклеточного матрикса как территориального, так и межтерриториального, зоны дегенерации метаэпифизарного хряща закладок бедренных костей человека на стадиях 9,10 недель внутриутробного развития человека (Рис. 3).
Рис. 3. Суммарная реакция с альциановым синим на хондроитинсульфат и кератансульфат в зонах гипертрофии и дегенерации метаэпифизарного хряща закладки бедренной кости предплода человека 9 недель пренатального развития из г. Астрахани. Окраска по Шубичу – Лопуновой. Об. 10, ок. 10
Обсуждение полученных результатов
Проведенное исследование показало, что процессы оссификации и минерализации в закладках бедренных костей человека на ранних стадиях пренатального онтогенеза (6 – 12 недель внутриутробного развития) связаны со значительными изменениями в синтезе, качественном составе и динамике накопления гликозаминогликанов.
Наиболее активный внутриклеточный синтез гликозаминогликанов наблюдается в хондроцитах зоны роста метаэпифизарного хряща. Секреторные вакуоли от комплекса Гольджи мигрируют к цитолемме, нагруженные молекулами протеогликанов, для экзоцитоза.
Если мы будем двигаться к зоне гипертрофии, то увидим, как синтез протеогликанов в хондроцитах постепенно затухает, но зато возрастает количество этих веществ, аккумулированное хрящевыми клетками на наружной поверхности своей цитолеммы и локализующееся в межклеточном пространстве.
Гликозаминогликаны, зафиксированные на поверхности цитолеммы хондроцитов, возможно, предназначены для формирования полноценных везикул матрикса, так как нами четко определено наличие этих полисахаридов в составе данных образований.
Принимая во внимание высокую аффинность ионов кальция к молекулам гликозаминогликанов, заслуживает внимания предположение, что эти вещества в мембране везикул матрикса играют роль первичных аккумуляторов кальция, необходимых для образования ядер кристаллизации. Не подлежит сомнению, что эту функцию гликозаминогликаны могут полноценно выполнять только в содружестве с другими факторами минерализации, в частности, с липидами и фосфолипидами.
Как показало гистохимическое исследование с применением характерных топооптических реакций на протеогликаны, в процессе развития закладок бедренных костей человека на стадиях от 6 до 12 недель пренатального развития в гиалиновой зоне, зонах пролиферации, роста и гипертрофии метаэпифизарного хряща наблюдается отчетливое уменьшение более нейтральных низкосульфатированных гликозаминогликанов с одновременным увеличением содержания веществ этой группы, проявляющих кислотный характер – хондроитинсульфатов и кератансульфата.
Данный процесс более активен в закладках из зоны с повышенной минерализацией окружающей среды.
Отмечается также тенденция к увеличению степени сульфатированности гликозаминогликанов закладок бедренных костей по мере развития зародыша и предплода человека. Интересен более быстрый рост содержания кератансульфата, что также в большей степени характерно для г. Махачкалы, – наиболее сульфатированного представителя данной группы полисахаридов, который, по мнению В.О. Песчанского [1], играет значительную роль в созревании оссифицирующегося хряща и подготовке его к минерализации.
С началом замещения хряща костной тканью, количество гликозаминогликанов, особенно кислых, в зонах минерализации и резорбции хрящевых закладок, по данным гистохимического исследования, значительно уменьшается, что, возможно, объясняется вступлением их в химические связи, необходимые для дальнейшего хода процессов остеогенеза и минерализации.
Относительно биологической роли той динамики накопления и изменения качественного и количественного состава гликозаминогликанов в хрящевых закладках бедренных костей человека, которую мы выявили, можно сделать предположение, что гелеобразные структуры из макромолекул протеогликанов, где преобладающим углеводным компонентом являются гиалуроновая кислота, как представитель несульфатированных гликозаминогликанов, или хондроитинсульфат и кератансульфат, относящихся к сульфатированным, значительно отличаются одна от другой по плотности и гидратированности. Наименее плотен и наиболее гидратирован гель, имеющий в своем составе преимущественно гиалуроновую кислоту, а наиболее плотен и наименее гидратирован, соответственно, гель с преобладанием кератансульфата.
Таким образом, накопление в хрящевом матриксе хондроитинсульфатов и, особенно, кератансульфата не может не отразиться на функции матрикса, так как делает его все более плотным и, следовательно, затрудняет транспорт в нем. Это приводит с течением времени к ухудшению условий существования хондроцитов, обусловливает дегенерацию и разрушение их. Изменение качественного состава матрикса хряща закладок – замещение в нем гидрофильных гликозаминогликанов гидрофобными высокосульфатированными приводит к вытеснению из матрикса воды, гипергидратируя хондроциты.
Всё это приводит, в конце концов, к полной дегенерации хондроцитов и их разрыву. Освобождающиеся при этом силой гидростатического давления полость гипертрофированного хондроцита заполняется периваскулярными, эндотелиальными и клетками крови, что является жизненно важным для процесса остеогенеза.
Резюмируя вышеизложенное с точки зрения влияния повышенного содержания микроэлементов, в частности, меди и селена, в окружающей среде на оссификацию и минерализацию закладок бедренных костей, необходимо признать активизирующее влияние этого внешнего фактора на данные процессы. Максимум этого влияния приходится на период от 9 до 10 недели пренатального развития человека. На более поздних стадиях онтогенеза воздействие повышенной минерализации на остеогенез прогрессивно уменьшается.