Металлы, обладая стабильностью, высокой миграционной активностью, склонностью к биоаккумуляции, наличию специфических токсических эффектов представляют опасность для здоровья [11, 14]. Потенциальному риску хронического воздействия группы тяжелых металлов подвержены работники предприятий горнорудной промышленности. Выраженное увеличение содержания ряда элементов (Cu, Zn, Cr, Pb, Hg, Cd, As) в волосах горняков, добывающих медно-цинковую колчеданную руду, демонстрирует их поступление и накопление в организме [1, 5, 16]. При изучении профессиональной и производственно обусловленной заболеваемости горнорабочих на предприятиях по добыче и обогащению цветных металлов установлено значительное распространение болезней органов пищеварения, а уровень заболеваемости коррелировал со стажем работы [1,2,12,13]. Исследования с моделированием интоксикации компонентами медно-цинковой колчеданной руды показали увеличение уровня биохимических маркеров функции печени в плазме крови, многократное повышение концентрации Zn, Cu, Cd и Pb в ткани органа [3, 5]. В механизмах токсического действия группы тяжелых металлов особое значение придается изменениям оксидантно-антиоксидного статуса тканей с развитием окислительного стресса [3,11,14].
Цель исследования: оценить уровень компонентов антиокислительной защиты печени экспериментальных животных при подострой интоксикации элементами, содержащимися в медно-цинковой колчеданной руде.
Материалы и методы. Опыт проведен на 70 самцах половозрелых белых крыс массой 200–240 г. Для моделирования подострой интоксикации элементами медно-цинковой колчеданной руды (Учалинское месторождение, Республика Башкортостан) животным в течение 3-х месяцев ежедневно внутрижелудочно вводили с помощью металлического зонда суспензию измельченного порошка руды в 2 % растворе крахмала из расчёта 60 мг/100 г массы. При расчёте вводимой дозы исходили из минимальной токсичной дозы меди [14] и среднего её содержания в руде 3,5 %. Крысы контрольной группы ежедневно получали 2 % раствор крахмала. Животные содержались в одинаковых условиях вивария на стандартном питании. Эксперименты проводили в соответствии с этическими нормами и рекомендациями о гуманном отношении к лабораторным животным, изложенными в «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных целях» и в соответствии с требованиями приказа Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
Животных выводили из эксперимента под лёгким эфирным наркозом через 1, 2 и 3 месяца. В гомогенатах печени исследовали содержание глутатиона восстановленного (ГВ) по [6], свободных сульфгидрильных групп белков (ССГ) по [17], α-токоферола [19], аскорбиновой кислоты [21], общую антиокислительную активность (ОАА) по [7], активности супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГПО) с использованием наборов реагентов фирмы «RandoxLaborLtd.», каталазы [8] и содержание белка по Лоури.
Результаты и обсуждение. Из приведённых в таблице данных следует, что длительное поступление компонентов медно-цинковой колчеданной руды вызывает в печени экспериментальных животных снижение уровня компонентов неферментативного звена и активности основных ферментов антиоксидантной защиты. Содержание глутатиона восстановленного к концу третьего месяца эксперимента уменьшается до 67,3 %, свободных тиоловых групп белков – до 71,5 % от уровня контроля. Концентрации витамина Е и витамин С в печени снижается более умеренно-соответственно до 88,4 % и 82,2 %.
Показатели антиоксидантной защиты печени крыс при интоксикации элементами медно-цинковой колчеданной руды
|
Показатели
|
Контрольная группа n=10 |
Опытная группа |
|
|
|
|
|
1 месяц |
2 месяца |
3 месяца |
|
ГВ, мкмоль/мг белка |
10,75 [7,79-13,18] |
10,65 [8,10-13,15] P=0,8445 |
7,80 [6,05-11,16] P=0,0604 |
7,30 [5,71-9,14] P=0,0409 |
|
CСГ белков, мкмоль/мг |
16,5 [13,4-19,3] |
15,3 [12,8-17, 6] P=0,5822 |
14,5 [12,6-15,3] P=0,1605 |
11,80 [10,2-14,6] P=0,0379 |
|
α – Токоферол, мкг/мг белка |
5,69 [4,95-6,36] |
4,91 [4,44-5,62] P=0,0343 |
4,90 [4,26-5,72] P=0,0365 |
5,03 [4,21-5,37] P=0,0378 |
|
Аскорбиновая кислота, мкг/мг белка |
12,4 [10,9-13,8] |
12,7 [10,2-13,7] P=0,7082 |
11,5 [10,6-12,3] P=0,3599 |
10,2 [9,9-11,8] P=0,0281 |
|
СОД, Ед/мг белка |
10,2 [7,2-11,4] |
8,4 [7,6-10,5] P=0,0435 |
7,4 [6,3-8,8] P=0,0311 |
7,6 [6,4-8,2] P=0,0366 |
|
ГПО, нмоль/мин/мг белка |
7,92 [6,64-9,74] |
7,85 [6,15-8,40] P=0,8282 |
5,55 [4,4-5,93] P=0,0262 |
5,35 [4,33-5,75] P=0,0178 |
|
Каталаза, ммоль/мин/мг белка |
8,3 [7,5-8,9] |
7,5 [6,3-8,7] P=0,1532 |
7,9 [5,7-7,8] P=0,6161 |
6,7 [5,4-7,8] P=0,0192 |
|
ОАА,% |
41,1 [36,2-48,4] |
40,4 [30,8-45, 6] P=0,7341 |
35,5 [30,1-41,9] P=0,0426 |
34,2 [26,5-38,3] P=0,0342 |
В то же время падение содержания α-токоферола обнаруживается уже через 1 месяц от начала эксперимента (p=0,0343), а ГВ, СТГ и аскорбата происходит более умеренно, постепенно достигая статистической значимости лишь к третьему месяцу. Аналогичная динамика наблюдается и при измерении общей антиокислительной активности ткани печени. Согласно мнению авторов, предложивших данный метод [7], ОАА характеризует преимущественно состояние неферментативного звена антиоксидантной защиты.
При длительном поступлении в организм элементов, содержащихся в медно-цинковой колчеданной руде, в печени снижается и активность более мощного – ферментативного звена антиокислительной защиты. Активность СОД к завершению второго месяца интоксикации составляет 72,5 % от исходного уровня (р=0,0311) и остается сниженной до конца эксперимента (р=0,0366). Активность ГПО также существенно падает на второй месяц введения суспензии порошка руды (до 70,1 %, р=0,0262) и в последующем продолжает снижаться. Более стабильная динамика изменений выявляется при изучении активности каталазы, которая статически значимого снижения достигает лишь к концу третьего месяца эксперимента.
В руде Учалинского месторождения содержание меди составляет 3,5 %, цинка – 5 %, серы 15–45 %, мышьяка 0,1–3,0 %, сурьмы 0,01–0,5 %, свинца 0,1–0,3 %, бария 0,2–7 %, кадмия 0,06–0,12 %. Постоянными сопутствующими компонентами являются хром, железо, серебро, золото, марганец, ртуть и другие элементы [1,12].
При действии металлов, содержащихся в руде, установленное снижение антиокислительной защиты в печени может быть следствием разных механизмов их действия. Так, ионы многих металлов образуют комплексы с биомолекулами, содержащими тио-(HS-) и алкилтиогруппировки (RS-), разрывают дисульфидные связи (-S-S- связи), нарушая макромолекулярные структуры белков и их функциональную активность [11,13]. Кроме того, такие элементы как Fe, Cu, Pb, Cd, Hg, Mn, Ni, содержащиеся в руде, индуцируют процессы свободнорадикального окисления липидов и белков, инициируя образование активных форм кислорода, и таким образом стимулируют повышенное потребление антиоксидантов в тканях [4,10].
Cистема глутатиона является одной из ведущих в антиоксидантной защите тканей, особенно в печени, где происходит наиболее интенсивный синтез этого трипептида [10,14]. Функции ГВ разнообразные. Он поддерживает в восстановленном состоянии свободные тиоловые группы белков, действует как прямой антиоксидант, инактивируя активные формы кислорода (гидроксил радикал, синглетный кислород, супероксиданион), стабилизирует мембраны перемещением ацилпероксидов, поддерживает клеточный гомеостаз аскорбиновой кислоты и токоферолов, участвуя в их восстановлении, входит в структуру ряда ферментов антиоксидантной защиты [4, 10, 14]. С одной стороны, снижение уровня ГВ при действии металлов может быть результатом выраженной интенсификации его потребления, с другой, может стать причиной снижения активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов – глутатион-пероксидазы, глутатионтрансферазы, липидпероксидглутатионпероксидазы.
Буферная ёмкость тиоловых соединений оказывает влияние на состояние неспецифической резистентности организма, процессы апоптоза и пролиферации, метаболизма клеток, функционирование внутриклеточных механизмов передачи регуляторных сигналов, группы факторов трансляции и их взаимодействия с регулярными боксами ДНК [22]. Выделено более 20 так называемых «редокс-чувствительных» транскрипционных факторов. Реагируя на колебания окислительно-восстановительного статуса, они способны изменять транскрипцию нескольких сотен генов, входящих в систему антиоксидант-респонсивного элемента (АРЭ), являющегося ключевым фактором в поддержании внутриклеточного гомеостаза при токсических и других воздействиях [18]. Выделяют при этом два основных механизма контроля активности факторов транскрипции: окисление серусодержащих цистеиновых и метиониновых остатков и взаимодействие с металлами переменной валентности, входящих в состав молекул таких редокс-сенсоров, как NF –kB, AP-1, Nrf-2 [20]. Действие активных форм кислорода через активацию АРЭ регулирует экспрессию важнейших факторов антиокислительной защиты и биотрансформации: ГПО, глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы, СОД, тиоредоксина, тиоредоксинредуктазы, гамма-глутамилцистеинлигазы, глюкуронидтрансферазы и др. [10,18]. АРЭ таким путем контролирует основные факторы синтеза глутатиона и поддержания его восстановленного состояния. Сохранение на уровне контроля в первый месяц воздействия элементов руды содержания ГВ, ССГ белков, активности ГПО и ОАА ткани печени животных опытной группы, вероятно, связано с механизмами активации АРЭ с напряжением систем биосинтеза и редукции глутатиона. Увеличение длительности поступления компонентов руды до трёх месяцев приводит к истощению механизмов поддержания и падению уровня неферментативных антиоксидантов и активности ферментов антиокислительной системы.
Активность и стабильность ключевых ферментов антиоксидантной защиты взаимосвязаны. СОД, каталаза и ГПО инактивируются одним из продуктов их ферментативной реакции, и согласованное действие этих ферментов является необходимым для эффективной защиты их от непосредственного инактивирующего действия образующихся активных форм кислорода [4]. При этом каталаза наиболее длительно сохраняет свою активность, фермент почти не требует энергии активации, и скорость его реакции лимитирует лишь скорость диффузии субстрата к активному центру [10].
ГВ тесно связан с обменом не только свободных тиоловых групп белков, но и с такими прямыми антиоксидантами, как токоферолы – главными перехватчиками радикалов в липидной фазе биомембран и аскорбиновая кислота, обладающей широким спектром действия и функционирующей с глутатионом в цитозоле клеток [4,9]. Хотя крысы и синтезируют аскорбат из глюкуроновой кислоты, но восстановление дегидроаскорбатного радикала осуществляется за счет глутатионового цикла, а сама аскорбиновая кислота важна для регенерации окисленного α-токоферола [10, 14]. Однако в присутствии ионов переменной валентности, особенно железа и меди, аскорбат проявляет прооксидантные свойства, и при избыточном поступлении металлов в условиях недостаточной их секвестрации аскорбиновая кислота может усугублять развитие окислительного стресса [4,10]. Накопление металлов переменной валентности в тканях опасно ещё и тем, что в среде легкоокисляемых соединений происходит их восстановление, и они выступают в качестве прооксидантов.
Заключение
Полученные результаты указывают на патогенетическую значимость функционирования антиоксидантной защиты ткани печени в условиях длительного поступления в организм элементов медно-цинковой колчеданной руды, что характеризуется снижением концентрации восстановленного глутатиона, свободных сульфгидрильных групп белков, α-токоферола и аскорбиновой кислоты, падением активности ключевых антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза), приводящее к нарушению про- и антиоксидантного статуса и дезорганизации метаболизма. Более детальная характеристика системы глутатиона, занимающей ведущее положение в снижении и предотвращения токсического действия металлов, содержащихся в медно-цинковой колчеданной руде, требует дальнейшего целенаправленного изучения.