По гистологическому строению более 95% форм рака пищевода являются плоскоклеточными. Плоскоклеточный рак пищевода развивается в возрасте 50-70 лет, у мужчин в 3-10 раз чаще, чем у женщин [10]. Резкие колебания в распространенности и соотношении заболеваемости между мужчинами и женщинами чаще всего объясняют неблагоприятными экологическими условиями среды обитания, наличием вредных привычек, характером питания. Частота рака нарастает от проксимального к дистальному отделу пищевода. Возникшие вначале очаговые или диффузные атрофические изменения слизистой оболочки трансформируются на фоне повышенной митотической активности эпителиальных клеток в очаги дисплазии и пролиферации. Неполноценный эпителий в зоне этих очагов в последующем перерождается в ранний рак пищевода.
Для выделения групп пациентов с возможностью рецидива заболевания и/или оценки лекарственной резистентности опухоли широко используется определение в опухолях молекулярно-биологических тканевых маркеров, многие из которых являются протеолитическими ферментами [4; 7]. Роль протеолиза в развитии неоплазии широко изучается, но остаётся много вопросов, связанных с вовлеченностью протеолитических ферментов в канцерогенез.
Ключевые процессы в морфогенезе тканей (миграция и пролиферация клеток) инициируются и опосредуются плазмином, активация плазминзависимого протеолиза обеспечивает стимуляцию ангиогенеза и неоваскуляризацию новообразований, плазминоген является единственным источником ангиостатина [2; 5]. Для многих локализаций рака установлено, что уровень и соотношение компонентов активации плазминогена, экспрессии плазмина и степень его инактивации α2-антиплазмином в опухолевой ткани могут служить показателем метастатической и инвазивной активности опухоли [6; 8; 11].
Цель исследования: изучение содержания плазминогена (ПГ), свободного плазмина (П) и связанного в комплекс с α2-антиплазмином (РАР), урокиназного активатора плазминогена (uPA), ингибитора-1 активаторов плазминогена (PAI-1) в тканях плоскоклеточного рака пищевода у мужчин и женщин в сравнительном аспекте.
Материалы и методы. Разрешение этического комитета РНИОИ на использование операционного материала для научных целей, а также информированное согласие пациентов получено до начала работы. Исследована опухолевая ткань плоскоклеточного рака пищевода без метастазов, её перифокальная зона от 40 больных (29 мужчин, 11 женщин в менопаузе, 38-72 лет, st II, G2, T2-3N0M0). Результаты сравнивали с гистологически неизменённой тканью из области линии резекции, которую считали условно здоровой. Гистологический контроль проводился во всех случаях. Все компоненты определяли в 10%-ных гомогенатах, приготовленных на стерильном физиологическом растворе, с последующим пересчётом на 1 г влажной ткани.
Методом ИФА со стандартными тест-наборами ELISA определяли плазмин, связанный в комплекс с α2-антиплазмином (РАР), урокиназный активатор плазминогена (uPA), ингибитор активаторов плазминогена-1 (PAI-1); плазминоген (ПГ) и свободный плазмин (П) определяли спектрофотометрическим методом. Статистика: обработку полученных цифровых данных осуществляли при помощи пакета сертифицированных прикладных программ Statistica v. 10 и Microsoft Excel XP. Достоверность различий между количественными показателями вычисляли с помощью t-критерия Стьюдента. Уровень р<0,05 принимали как значимый.
Результаты и обсуждение. Система фибринолиза, помимо тромболизиса, играет важную физиологическую и патологическую роль в ряде других жизненно важных процессов: деградации внеклеточного матрикса, эмбриогенезе, миграции клеток, ремоделировании тканей, заживлении ран, ангиогенезе, воспалении и миграции опухолевых клеток [2; 9]. Во всех образцах ткани пищевода обнаружены ПГ, П, РАР, uPA и PAI-1 и установлены достоверные гендерные различия.
Содержание ПГ и П в ткани по линии резекции у мужчин и женщин не различалось (табл.). В ткани опухоли содержание ПГ у мужчин было выше, чем у женщин, в 5,0 раз; у женщин, в сравнении с тканью по линии резекции, оно было понижено в 3,3 раза, а у мужчин – повышено в 1,4 раза (р<0,01). В ткани, окружающей опухоль или её перифокальной зоне, содержание ПГ у мужчин было в 2,1 раза выше, чем у женщин. При этом, относительно условно здоровой ткани по линии резекции, содержание плазминогена было понижено у мужчин в 1,2 раза (р<0,05), у женщин – в 2,3 раза. Активность П в ткани по линии резекции у всех больных была достоверно ниже, чем в остальных образцах, но у мужчин в 1,4 раза выше, чем у женщин (табл.). В ткани опухоли плоскоклеточного рака пищевода и её перифокальной зоне у мужчин активность П была в 3,4 и 2,8 раза выше, чем в ткани по линии резекции. У женщин в ткани опухоли и её перифокальной зоне активность П была выше, чем в ткани по линии резекции в 2,8 и 3,5 раза, соответственно. По активности П в ткани опухоли установлены достоверные различия: у мужчин в 1,7 раза выше, чем у женщин. В перифокальной зоне различия в активности П между тканями мужчин и женщин статистически не подтвердились: р=0,0508.
Важную информацию могут дать коэффициенты соотношения «предшественник/фермент», в данном случае – ПГ/П (табл.).
Фибринолитическая система при раке пищевода без метастазов у женщин и мужчин
|
Плоскоклеточный рак (T2-3N0M0), M±m |
||||||
|
Вид ткани |
Линия резекции |
Перифокальная зона |
Опухоль |
|||
|
Пол больных |
мужчины |
женщины |
мужчины |
женщины |
мужчины |
женщины |
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
|
ПГ КЕ/г |
51,15±4,0 |
46,26±3,3 |
42,60±3,2 1 |
20,49±1,5 2,3 |
69,41±5,1 1, 3 |
13,91±1,2 2, 4,5 |
|
П КЕ/г |
28,63±2,2 |
20,46±1,4 |
79,98±6,1 1 |
72,36±5,8 2 |
96,14±7,1 1, 3 |
56,55±4,5 2, 4,5 |
|
РАР мкг/г |
7,917±0,6 |
9,760±0,7 1 |
9,550±0,7 1 |
10,11±0,9 |
8,317±0,7 |
9,160±0,8 |
|
uPA-АГ нг/г |
12,24±0,9 |
13,0±0,9 |
14,26±1,1 1(р=0,05) |
13,20±0,9 |
73,34±5,2 1, 3 |
56,40±3,9 2, 4,5 |
|
uPA-акт ед/г |
0,202±0,02 |
0,160±0,01 1 |
0,268±0,02 1 |
0,140±0,0 1, 3 |
3,350±0,2 1, 3 |
0,321±0,02 2, 4,5 |
|
PAI-1-АГ нг/г |
108,2±8,1 |
76,80±5,1 1 |
111,1±8,6 |
258,6±16,8 2 |
1033±71,8 1, 3 |
592,7±43,1 2, 4,5 |
|
PAI-1-акт ед/г |
7,188±0,5 |
7,10±0,5 |
9,588±0,7 1 |
9,40±0,7 2 |
34,24±2,6 1, 3 |
10,2±0,7 2, 5 |
|
Расчётные коэффициенты соотношений взаимосвязанных показателей |
||||||
|
ПГ/П |
1,8±0,1 |
2,3±0,2 1 |
0,5±0,04 |
0,3±0,02 2,3 |
0,7±0,05 1, 3 |
0,3±0,02 2, 4,5 |
|
П/РАР |
3,6±0,2 |
2,1±0,2 1 |
8,4±0,6 |
7,2±0,5 2,3 |
11,6±0,9 1, 3 |
6,2±0,5 2, 5 |
|
uPA-АГ/uPA-акт |
60,6±4,4 |
81,3±5,5 1 |
53,2±4,1 |
94,3±6,5 2,3 |
21,9±1,7 1, 3 |
175,7±11,92, 4,5 |
|
PAI-1-акт/uPA-акт |
35,6±2,6 |
44,1±3,2 1 |
35,8±2,7 |
67,10±4,8 2,3 |
308,4±22,7 1, 3 |
31,9±2,1 2, 4,5 |
|
PAI-1-АГ/PAI-1-акт |
15,1±1,2 |
10,8±0,8 1 |
11,6±0,8 |
27,5±1,9 2,3 |
30,2±2,3 1, 3 |
58,1±4,1 2, 4,5 |
Примечание: индекс достоверности соответствует номеру столбца, с которым сравнивали числовые значения (р<0,05).
При относительном сходстве содержания плазминогена и активности свободного плазмина в условно здоровой ткани по линии резекции мужчин и женщин соотношение ПГ/П достоверно выше у женщин – в 1,3 раза (р<0,05). В остальных тканях, сравнительно с областью линии резекции, соотношение ПГ/П было резко снижено и у мужчин, и у женщин (табл.). Содержание РАР, относительно области линии резекции, было относительно постоянным во всех тканях. Соотношение свободного и связанного плазмина (П/РАР) в тканях может оказаться решающим фактором в сохранении или нарушении стабильности межклеточного матрикса, особенно при онкологической патологии. В ткани по линии резекции у мужчин соотношение П/РАР в 1,4 раза выше, чем у женщин (табл.). Коэффициент П/РАР был повышен во всех тканях относительно области линии резекции, но в опухоли и её перифокальной зоне у мужчин в 1,4 и 1,2 раза (р<0,05), соответственно, выше, чем в аналогичных тканях женщин.
При изучении содержания урокиназного активатора плазминогена мы определяли две его формы: антигенную, т.е. проурокиназу (uPA-АГ) и активную, т.е. урокиназу (uPA-акт). В условно здоровой ткани при практически одинаковом содержании uPA-АГ наблюдали достоверные различия в количестве uPA-акт – у мужчин в 1,3 раза выше, чем у женщин (табл.). В перифокальной ткани опухоли различия усилились: при сравнимом содержании uPA-АГ, у мужчин в 1,9 раза больше uPA-акт. В ткани опухоли регистрировались не только увеличившаяся разница между содержанием uPA-акт – в 10,4 раза, но повышение количества uPA-АГ у всех больных и у мужчин в 1,3 раза выше, чем у женщин.
Одновременно было установлено, что активная форма специфического ингибитора урокиназы PAI-1-акт в условно здоровой ткани области линии резекции у мужчин и женщин содержится в одинаковом количестве (табл.). Количество его предшественника (антигенной формы) PAI-1-АГ у мужчин в 1,4 раза больше, чем у женщин. В перифокальной зоне PAI-1-акт увеличивается в 1,3 (р<0,05) раза и у мужчин, и у женщин. PAI-1-АГ у мужчин соответствует области линии резекции, у женщин – выше, чем в ткани по линии резекции в 3,4 раза. В опухоли у мужчин содержание PAI-1-акт в 3,4 раза выше, чем у женщин, и в 4,8 раза выше, чем в ткани по линии резекции. В опухолевой ткани регистрировали и наибольшее содержание PAI-1-АГ у мужчин: не только в 9,6 раза выше, чем по линии резекции, но и в 1,7 раза выше, чем у женщин (табл.).
Повышение уровня П, uPA и PAI-1 регистрировалось раке при раке других локализаций [7; 8; 11].
Наши результаты свидетельствуют о более высокой активности П в опухолевых тканях мужчин сравнительно с тканями женщин, следовательно, стабильность межклеточного матрикса нарушается у мужчин в большей мере, чем у женщин. При неизбежной активации системы фибринолиза в злокачественно трансформированной ткани, заметно, что ПГ в перифокальной ткани мужчин пополняется, а у женщин наблюдается его истощение, сохраняющееся в опухоли. Подтверждением тому служат и повышенное содержание ПГ в ткани опухоли у мужчин, и различия в соотношении ПГ/П (табл.). Это позволяет предполагать продукцию его опухолью, тем более что в перифокальной зоне опухоли у мужчин содержится наименьшее количество ПГ, сравнительно с остальными тканями мужчин. Примерно одинаковое связывание П в комплекс РАР в исследованных тканях (табл.) может быть косвенным свидетельством подавления активности и/или синтеза эндогенного α2-антиплазмина в опухоли и её перифокальной зоне.
Почти такая же картина наблюдалась и в отношении uPA (табл.). В условно здоровой ткани пищевода мужчин и женщин было примерно одинаковое содержание uPA-АГ, причём его количество не изменилось и в ткани, окружающей опухоль (табл.). В ткани опухоли мужчин содержалось наивысшее количество uPA, и это, наряду с высоким содержанием ПГ, создавало условия для усиленной его активации и образования П. Распределение PAI-1 по изученным тканям (табл.) потенциально должно было бы сдерживать активность uPA в опухоли и её перифокальной зоне, однако, по всей видимости, этого не происходит, поскольку П в этих областях образуется достаточно активно, что способствует разрушению окружающей опухоль базальной мембраны и внеклеточного матрикса, освобождая место для её роста. Проникая в перифокальную зону опухоли и у мужчин, и у женщин П может способствовать расширению «опухолевого поля». Можно полагать, что в ткани опухоли плоскоклеточного рака пищевода происходит выделение опухоль-ассоциированных ПГ, uPA и PAI-1 клетками опухоли, причём в большей степени у мужчин. Известно, что PAI-1 обладает протуморогенной активностью за счёт реализации антиапоптотических функций [5].
Система фибринолиза участвует в физиологическом и патологическом ангиогенезе. Деградация межклеточного матрикса является ключевым моментом в росте, инвазии и метастазировании опухолей, в ней принимают участие несколько классов протеаз: сериновые протеиназы, включая плазмин, матричные металлопротеиназы, многие из которых активируются плазмином, и др. Учитывая гендерные различия в заболеваемости плоскоклеточным раком пищевода и литературные данные, правомерно предположение о различном влиянии мужских и женских половых гормонов на механизмы активации uPA, ПГ, PAI-1 при развитии этой патологии. Андрогенные рецепторы широко экспрессируются в тканях человека и были определены в тканях рака различной локализации, в том числе пищевода. В обзоре O.A. Sukocheva et al. [10] приведены конкретные результаты исследований, касающиеся влияния андрогенов и эстрогенов на развитие плоскоклеточного рака пищевода у мужчин и женщин. Авторы пришли к выводу, что экспрессия андрогенов и их рецепторов стимулирует биологическую активность злокачественной опухоли, и в частности плоскоклеточного рака пищевода, а также влияет на прогноз заболевания. Присутствие андрогенных рецепторов в ткани рака пищевода, а также прямая связь между увеличением тестостерона и развитием «пищевода Барретта» позволили M.B. Cook et al. [3] предположить, что андрогены играют значимую роль в развитии плоскоклеточного рака пищевода. В обзоре M. Schuliga et al. [9] освещена связь экспрессии системы регуляции плазминогена, в частности uPA и PAI-1, с инвазией рака, в том числе пищевода.
Таким образом, развитие плоскоклеточного рака пищевода у мужчин и женщин связано, вероятно, с гендерными различиями в изменениях каскада регуляции ПГ, образовании и сохранении свободного П с преобладанием влияния мужских половых гормонов. Найденные нами гендерные различия важнейших белков системы фибринолиза в тканях плоскоклеточного рака пищевода могут способствовать конкретизации имеющихся сведений, однако важно выяснить влияние андрогенов на развитие и прогрессирование этой опухоли. Необходимы дальнейшие исследования для уточнения роли андрогенов и их рецепторов в формировании внутриклеточной сигнализации и каскада регуляции плазминогена в плоскоклеточном раке пищевода. Возможно, это поможет объяснить преобладание мужчин в статистике заболеваемости.
Выводы
- Установлены достоверные гендерные различия содержания uPA, плазминогена, плазмина и PAI-1 в тканях плоскоклеточного рака пищевода и перитуморальной зоне.
- В ткани опухоли плоскоклеточного рака пищевода и её перифокальной зоне возможно наличие опухоль-ассоциированных uPA, ПГ и PAI-1 у мужчин, PAI-1 – у женщин.