Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

EVALUATION OF THE EFFECTIVENESS OF JOINT APPLICATION OF ANTIBIOTICS AND PROBIOTICS IN VITRO

Sizentsov A.N. 1 Karpova G.V. 1 Volodchenko V.F. 1 Timofeeva A.A. 1
1 Orenburg State University
В статье представлены данные по изучению эффективности совместного применения пробиотических препаратов на основе бактерий рода Bacillus с антибиотиком в отношении S. еnteritidis. В ходе проведения экспериментов in vitro были установлены родовая устойчивость бактерий рода Bacillus к цефтазидиму, азтреонаму, колистину и видовая устойчивость B. cereus к пенициллину, B. subtilis 534 к хлорамфениколу; B. licheniformis ВКПМ В 7048 и B. subtilis ВКПМ В 7038 к цефотаксиму. При определении антибиотикопродуктивности было установлено, что наибольшая выработка антибиотикоподобных веществ происходит на третьи сутки культивирования исследуемых штаммов микроорганизмов. В ходе определения аддитивного эффекта исследуемых пробиотических штаммов с антибиотиками установлено, что в отношении возбудителя сальмонеллезной инфекции эффективными являются комплексы B. subtilis 534 с пенициллином, а также B. licheniformis ВКПМ В 7048 и B. subtilis ВКПМ В 7038 с цефотаксимом, B. cereus с пенициллином.
The article presents data on studying of efficiency of application of probiotic preparations on basis of bacteria of the genus Bacillus with antibiotic against S. еnteritidis. During in vitro experiments it was established the generic resistance of bacteria of the genus Bacillus to ceftazidime, aztreonam, colistin and species B. cereus resistant to penicillin, B. subtilis 534 to chloramphenicol; B. licheniformis 7048 and B. subtilis 7038 to Cefotaxime. In determining antibioticproduction it was found that the largest generation of antibiotikoterapii substances takes place on the third day of cultivation of the studied strains of microorganisms. In the course of determining the additive effect of the studied probiotic strains with antibiotics found that against the causative agent Salmonella infection effective are the complexes of B. subtilis 534 penicillin, and B. licheniformis 7048 and B. subtilis 7038 with Cefotaxime, B. cereus penicillin.
Bacillus
antibiotic
sporobakterin
Vetom
Baktisubtil
additive effect

Микробиоценоз пищеварительного тракта человека составляет более 500 видов микроорганизмов, при этом их количество в различных отделах желудочно-кишечного тракта неодинаково и варьирует в широком диапазоне. Наиболее многочисленными представителями нормофлоры кишечника являются Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp., E. coli, Bacterioides sp., Clostridium sp., анаэробные стрептококки и другие микроорганизмы. Микрофлора ЖКТ участвует в процессах переваривания и всасывания, обеспечивает трофику кишечника, синтез витаминов, антиинфекционную защиту [1; 7].

Экзогенные и эндогенные факторы могут оказывать существенное влияние на качественный состав кишечной нормофлоры, что в свою очередь не только нарушает течение физиологических процессов, но и способствует развитию тяжелых патологических состояний. Количественное и качественное изменение состава кишечной нормофлоры называют дисбактериозом кишечника. Наиболее распространенной причиной развития дисбактериоза является антимикробная химиотерапия, оказывающая прямое антагонистическое действие на представителей нормофлоры и существенно изменяющая «микробный пейзаж» пищеварительного тракта. В связи с этим при лечении антибиотиками и другими антимикробными препаратами рационально назначение пробиотических лекарственных средств во время проведения антибактериальной химиотерапии.

Успехом комплексного применения антибиотика и пробиотика является субэффективная концентрация антимикробного препарата в пищеварительном тракте и определенная резистентность пробиотического штамма к АМП. Пероральный прием антимикробного препарата дает возможность использования временного интервала, что в свою очередь позволяет назначать пробиотический препарат после снижения концентрации антибиотика в просвете кишечника до минимальных значений. Помимо этого, возможно использование сведений о резистентности пробиотических штаммов к АМП [2; 4; 6].

Также необходимо учитывать, что эффективность комплексной терапии повышается в том случае, если и пробиотический штамм и антибиотик являются синергистами, так как их совместное действие снижает частоту появления побочных эффектов этиотропной терапии и повышает эффективность эрадикационной. Таким образом, совместное применение антибиотиков и пробиотиков позволит снизить риск развития дисбактериоза или уменьшить его тяжесть.

Исходя из выше перечисленного перед нами была поставлена следующая цель исследования: определение эффективности совместного применения пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus с антибиотиками.

Объектами наших исследований являлись чистые культуры пробиотических штаммов микроорганизмов: Bacillus subtilis 534 (из биопрепарата «Споробактерин»), Васillus сеrеus IР 5832 (из биопрепарата «Бактисубтил»), а также были получены отдельные чистые культуры Васillus subtilis ВКПМ В 7038 и Васillus licheniformis ВКПМ В 7048, входящие в состав «Ветом 2».

Для определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus, входящих в состав пробиотиков, нами использовались следующие методы: метод определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus с применением тест-систем Bio Merieux; диско-диффузионный метод (ДДМ) определения антибиотикорезистентности; метод последовательных разведений [5].

Для определения антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus, входящих в состав пробиотиков, нами использовались следующие методы: метод определения антибиотикопродуктивности микроорганизмов на твердых питательных средах (метод агаровых блочков); метод определения антибиотикопродуктивности микроорганизмов при культивировании их в жидких питательных средах (метод с агаровыми лунками) [5].

Оценку эффективности совместного применения антибиотиков и пробиотиков определяли по следующей схеме (рисунок 1).

Рис. 1. Схема определения влияния антибиотика и пробиотика на подавление тест-организма в отдельности и совместно

Чашки Петри с МПА засеяли сплошным «газоном» тест-организмами (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis). Затем с помощью пробойника сделали три лунки (диаметр 6 мм) и внесли: в первую 30 мкл фильтрата, инкубированного 72 часа + 30 мкл физраствора, во вторую – 30 мкл антибиотика определенной концентрации, к которому условно-патогенные микроорганизмы оказались умеренно чувствительными + 30 мкл питательного бульона, а бактерии рода Bacillus – устойчивы, а в третью лунку – 30 мкл фильтрата + 30 мкл антибиотика, для того чтобы определить их влияние друг на друга.

Первоначальным этапом нашего исследования было определение антибиотикорезистентности пробиотических препаратов («Споробактерин», «Бактисубтил», «Ветом 2») на основе бактерий рода Bacillus с применением тест-систем Bio Merieux и ДДМ.

Критерием отбора антибиотиков для ДДМ, к которым исследуемые штаммы микроорганизмов проявляли резистентность, послужило определение антибиотикочувствительности с использованием тест-систем Bio Merieux, чтобы отобрать антибиотики, к которым бактерии рода Bacillus устойчивы, а тест-организмы – умеренно чувствительны. В соответствии с данным методом было установлено, что все четыре штамма бактерии рода Bacillus оказались устойчивы к пенициллину, оксациллину, тикарциллину, мециллинаму, цефуроксиму, цефтазидиму, цефлулодину, цефиксиму, цефотаксиму, имипенему, линкомицину, хлорамфениколу, азтреонаму и колистину.

S.еnteritidis оказалась умеренно чувствительна к пенициллину, ко всем антибиотикам из группы аминогликозидов, к цефуроксиму, цефокситину, цефоперазону, цефиксиму, цефотаксиму и хлорамфениколу.

На следующем этапе антибиотикорезистентность проверяли ДДМ с использованием стандартных дисков, содержащих антибиотики (табл.1).

Таблица 1

Сравнительная таблица по антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus, входящих в состав пробиотиков, с применением ДДМ (мм)

Антибиотики

Исследуемые тест-организмы

Bsubtillis 534

Bcereus

5832

Blichenoformis ВКПМ В 7048

Bsubtillis

7038

S. еnteritidis

1

2

3

4

5

8

Penicilline

25,0±0,58

R

R

21,7±0,33**

20,7±0,67**

Ampicilline

26,0±0,58

17,7±0,33***

30,7±0,67

24,3±0,33*

25,7±0,67

Oxacilline

30,3±0,33

14,7±0,33***

26,0±0,58**

22,0±0,58***

R

Streptomycine

25,3±0,33

34,0±0,58

32,0±0,58

32,0±0,58

18,3±0,33***

Kanamycine

27,0±0,58

20,7±0,67**

25,0±0,58

25,0±0,58

22,0±0,58**

Gentamicine

35,0±0,58

30,3±0,88*

29,7±0,33**

29,3±0,33**

23,7±0,33***

Netilmicine

33,3±0,33

34,0±0,58

26,0±0,58***

32,3±0,88

21,3±0,67***

Cefalexine

35,0±0,58

29,7±0,33**

29,7±0,33**

32,3±0,67*

29,3±0,33**

Cefotaxime

36,3±0,67

20,0±0,58***

R

R

12±0,33***

Cefasoline

30,7±0,67

32,7±0,33

32,3±0,33

30,3±0,88

32,0±1,00

Cefixime

20,0±0,58

R

R

15,0±0,58**

29±1.76

Меропенем

34,0±0,58

32,0±0,58

29,3±0,67

35,3±0,33

30,0±0,58**

Imipeneme

45,7±0,67

38,0±1,15**

41,3±0,67*

41,0±0,58**

22,0±0,58***

Aztreonam

R

R

R

R

R

Vancomycine

21,3±0,88

17,7±0,33*

18,7±0,67

16,7±0,67*

22,7±0,33

Tetracycline

25,3±0,33

21,3±0,33**

22,7±0,33**

26,3±0,33

22,0±1,15*

Lincomycine

20,0±0,58

18,0±0,58

21,0±0,58

25,7±0,67

13,3±0,67**

Clindomycine

26,7±0,67

29,3±0,67

27,0±0,58

28,0±0,58

R

Erythromycine

33,0±0,58

28,3±0,88*

26,0±0,58**

30,3±0,33*

R

Chlorampheni-kol

R

22±0,91

24±0,58

27±0,17

13±0,21

Colistine

R

R

R

R

16,7±0,67

R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,050; ** Р < 0,010; *** Р < 0,001.

 

По результатам ДДМ B. licheniformis 7048 и B. subtilis 7038 оказались устойчивыми к цефотаксиму, азтреонаму, а Bcereus и B. licheniformis еще и к пенициллину, а Bsubtillis 534 устойчив к хлорамфениколу. Все четыре штамма бактерии рода Bacillus проявили чувствительность к аминогликозидам, тетрациклинам, линкозамидам, макролидам. Полученные результаты полностью соответствуют результам, полученным Дроздовой Е.А. и Щербаковой Н.В. при изучении резистентности пробиотических штаммов микроорганизмов к антибиотикам [3].

Наиболее устойчивым является штамм Bcereus 5832, поскольку дает наименьшие зоны подавление антибиотиками, а Bsubtillis 534 более чувствителен к антибиотикам, так как для него характерны наибольшие зоны подавления роста. S. еnteritidis как тест-организм является устойчивой ко многим антибиотикам.

Исходя из проведенных предварительных исследований нами были отобраны те антибиотики, к которым бактерии рода Bacillus оказались устойчивыми (Пенициллин и «Бактисубтил»; Цефотаксим и «Ветом 2» Хлорамфеникол и «Cпоробактерин»), а S. еnteritidis умеренно чувствительна.

Следующим этапом было определение минимально подавляющих концентраций (МПК) изучаемых антибиотиков на рост исследуемых микроорганизмов. с этой целью мы использовали метод последовательных разведений (табл. 2).

Таблица 2 

Определение МПК пенициллина, цефотаксима, хлорамфеникола методом последовательных разведений

Исследуемые объекты

Антибиотик

Разведение антибиотиков

1:1

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

1:128

1:256

1:512

Концентрация, ЕД

1 млн

500 тыс.

250 тыс.

125 тыс.

62,5 тыс.

31,25 тыс.

15,63 тыс.

7,81 тыс.

3,9 тыс.

1,95 тыс.

B. cereus

Пенициллин

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

S. etnteritidis

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

Концентрация, г

5

2,5

1,25

0,63

0,32

0,16

0,08

0,04

0,02

0,01

B. licheniformis ВКПМ В 7048

Цефотаксим

-

-

-

-

-

+

+

+

+

+

B. subtilis 7038

-

-

-

-

-

-

+

+

+

+

S. etnteritidis

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

B. subtilis 534

Хлорамфеникол

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

S. etnteritidis

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

 

Анализ ряда разведений растворов антибиотиков позволил определить концентрации, которые оказывают бактерицидное и бактериостатическое действие на исследуемые микроорганизмы, а также концентрации, которые не оказывают влияния на рост.

Для решения второй задачи нами проводились исследования по изучению антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus, в ходе которых была выявлена их антагонистическая активность относительно тест-организмов.

В первую очередь мы попытались определить, на какие сутки происходит наибольшая выработка антибиотикоподобных веществ в питательную среду. Для этого мы использовали метод с агаровыми лунками. Бактерии рода Bacillus выращивали в питательном бульоне в течение 48, 72 и 96 часов. В дальнейшем опыте использовали фильтрат от бактерий, по результатам которого установили, что максимальная выработка антибиотикоподобных веществ осуществляется через 72 часа культивирования микроорганизма. Это можно объяснить ростом популяции бактерий и конкуренцией за питательные компоненты среды.

Изначально антибиотикопродуктивность бактерий рода Bacillus изучили при их культивировании на твердых питательных средах с использованием метода агаровых блочков (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительная таблица по антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus методом агаровых блочков 

Название

штамма

B.subtillis 534

B.cereus IP 5832

B.lichenoformis ВКПМ В 7048

B.subtillis ВКПМ В 7038

S. enteritidis

26,0±0,58

22,7±0,33

23,3±0,33

24,3±0,67

 

Дальнейшие исследования по определению антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus проводили при культивировании на жидких питательных средах методом агаровых лунок и методом наложения дисков, пропитанных антибиотиками. Данные по зонам подавления тест-организма Salmonella enteritidis методом агаровых лунок представлены в табл. 4.

Таблица 4

Сравнительный анализ антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus

методом агаровых лунок

Название

штамма

B.subtillis 534

B.cereus IP 5832

B.lichenoformis ВКПМ В 7048

B.subtillis ВКПМ В 7038

S. enteritidis

11,0±0,58

8,7±0,33

10,3±0,33

9,3±0,67

 

Анализ экспериментальных данных (табл. 4) свидетельствует о том, что выраженной антагонистической активностью в отношении тест-организмов обладает штамм B. subtillis 534, а наименее выраженной - B. cereus. Зона подавления роста тест-организмов находится в прямой зависимости от концентрации вырабатываемых антибиотических соединений бактериями рода Bacillus. При применении метода с наложением дисков также были получены диаметры зон подавления роста тест-организмов, были получены аналогичные результаты.

Эффективность совместного использования антибиотиков и пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus. В этом случае можно установить явление синергизма (или аддитивность), когда происходит суммация антагонистического действия антибиотиков и пробиотиков, что имеет большую практическую значимость. Также можно зарегистрировать либо негативный эффект (антагонизм), когда антибиотикоподобные вещества, вырабатываемые бактериями, могут блокировать мишени действия антибиотиков, либо отсутствие какого-либо эффекта.

В связи с этим, учитывая результаты определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus к антибиотикам, мы провели опыт по изучению эффективности совместного действия антибиотических препаратов и пробиотических штаммов на условно-патогенные микроорганизмы (рис. 2).

Рис. 2. Метод по совместному применению антибиотика и пробиотика на основе бактерий рода Bacillus: 1 – фильтрат, 2 – антибиотик, 3 – антибиотик + фильтрат

На рис. 2 показан результат совместного применения антибиотика цефиксима (левый рисунок) и B. cereus при подавлении Salmonella enteritidis, пенициллина (правый рисунок) и B. lichenoformis ВКПМ В 7048 при действии на Salmonella enteritidis.

Далее представлена обобщающая табл. 5 по эффективности совместного применения антибиотиков и пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus.

Представленные в табл. 5 данные позволяют нам выделить пару антибиотик и пробиотик, которая подавляет тест-организм Salmonella enteritidis in vitro и, следовательно, дальнейшее использование этой пары in vivo при лечении сальмонеллеза.

Таблица 5

Экспериментальная оценка эффективности комплексного применения антибиотиков и пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus

Штамм

Salmonella enteritidis

Пенициллин

Цефотаксим

Хлорамфеникол

B. subtillis 534

Н

Н

А

B. cereus IP 5832

А

Н

О

B. licheniformis ВКПМ В 7048

А

А

Н

B. subtillis ВКПМ В 7038

Н

А

О

Примечание: А – аддитивный эффект, Н – негативный эффект, О – отсутствие эффекта