Метаболический синдром (МС) представляет собой совокупность гормональных и метаболических нарушений, клинически проявляющихся в развитии ожирения, сахарного диабета и сердечно-сосудистых заболеваний. МС характеризуется инсулинорезистентностью, гиперинсулинемией, артериальной гипертензией и увеличением массы висцерального жира, что вызывает нарушения углеводного, липидного и пуринового обменов [7]. Эффективность фармакотерапии МС оценивается с позиции предотвращения развития заболеваний, связанных с атеросклерозом, атеротромбозом и их осложнений [3]. На сегодняшний день существует ряд лекарственных препаратов, воздействующих практически на все стадии метаболизма липидов, однако в современной литературе развернулась дискуссия о возможных нежелательных последствиях вмешательства в липидный метаболизм [5]. Для лечения МС необходим многофакторный подход, поэтому поиск гиполипидемических средств, восстанавливающих как нормальную работу поджелудочной железы, так функцию гемостатической системы организма, крайне актуален.

В организме человека при протеолизе и синтезе коллагена постоянно образуются короткие регуляторные пептиды глипролинового ряда, включающие в себя последовательности Pro-Gly, Pro-Gly-Pro, Gly-Pro, содержащие такие аминокислоты как глицин и пролин [1,6], которые обеспечивают сохранение нормального жирового обмена [2]. Ранее нами было показано, что регуляторные пептиды глипролинового ряда способствуют сохранению нормальной функции противосвертывающей системы и работы поджелудочной железы при стойкой гипергликемии и развитии экспериментального сахарного диабета 1-го типа у крыс [5, 8].

Цель настоящей работы заключалась в выявлении корригирующего действия регуляторных пептидов Pro-Leu-Pro, Pro-Leu-Pro-Ala, Pro-Gly-Pro-Ala и Phe-Pro-Leu-Pro-Ala на уровень общего холестерина, липидный профиль, нормализацию индекса массы тела и уровень глюкозы крови в условиях invivo на модели крыс с экспериментальным метаболическим синдромом.

Материал и методы исследования

В работе применялись пептиды Pro-Leu-Pro, Pro-Leu-Pro-Ala, Pro-Gly-Pro-Ala и Phe-Pro-Leu-Pro-Ala, синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН (Москва). Эксперимент был проведен на 60 беспородных белых крысах-самцах в возрасте к началу опыта (к началу кормления высококалорийным рационом) 2 мес с массой тела 200±10 г. Работа с животными была проведена в соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.).

Индуцирование метаболических нарушений вызывали высококалорийным рационом (ВКР), с избыточным содержанием углеводов и насыщенных жиров, выбранным на основании предыдущих исследований [4]. Энергетическая ценность ВКР составляла 130 % от стандартного рациона. Содержание крыс в течение 6 недель на ВКР приводило к развитию нарушений липидного обмена, ожирению и увеличению глюкозы в крови, что соответствовало показателям в группе животных, в дальнейшем обозначаемой как Контроль.

Через 6 недель от начала содержания крыс на высококалорийной диете животные были разделены на 5 групп. Первой группе интраназально вводили пептид Pro-Leu-Pro (Опыт 1), 2-ой – Pro-Leu-Pro-Ala (Опыт 2), 3-ей – Pro-Gly-Pro-Ala (Опыт 3), 4-ой – Phe-Pro-Leu-Pro-Ala (Опыт 4) в дозе 50 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 7 суток. Контрольные животные получали в те же сроки и подобным образом вместо пептида 0,85 %-ый NaCl (группа Контроль). В эксперименте использовали нормальных здоровых (интактных) крыс, которые содержались на обычном лабораторном рационе, имея свободный доступ к воде и не получая никаких препаратов (группа Норма).

Через 20 ч после последнего 7-го введения пептидов опытным животным или физиологического раствора контрольным крысам у них отбирали кровь для исследований, после чего отменяли введение препаратов. Повторное взятие крови осуществляли через 7 дней после отмены введения исследуемых пептидов или NaCl при продолжающемся содержании животных на высококалорийном рационе с глюкозой.

Взятие крови у крыс осуществляли натощак из яремной вены (v. jugularis) с использованием в качестве консерванта 3.8 %-ного раствора цитрата натрия в соотношении кровь: консервант как 9 : 1. Образцы крови центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин для получения бедной тромбоцитами плазмы.

Показатели жирового обмена в плазме крови исследовали энзиматическим колориметрическим методом с использованием набора реагентов фирмы Ольвекс-Диагностикум (Россия). При этом определяли концентрацию общего холестерина (ОХ), концентрацию холестерина липопротеидов низкой плотности (Хс-ЛПНП), концентрацию триглицеридов (ТГ).

Концентрацию глюкозы в крови определяли на биохимическом анализаторе One Touch Horison (США), используя специальные тест-полоски для данного прибора.

Все данные были обработаны статистически по непараметрическому критерию Вилкоксона (программа STATISTICA 6.0).

Результаты исследования и их обсуждение

Взвешивание животных проводили до начала эксперимента, т.е. до начала содержания крыс на жировом рационе, затем через 6 недель после нахождения на жировой диете (перед 1-ым введением пептида или физиологического раствора), через 20 ч после последнего (7-го) введения пептида и спустя 7 суток после отмены его применения.

Можно видеть, что интраназальное введение четырех исследуемых пептидов на фоне высококалорийной жировой диеты приводило к замедлению роста массы тела во всех опытных группах. После 7-кратного применения пептидов все опытные крысы поправились в среднем на 10.0 (2 и 4 группы) – 14.2 (3 группа) г, тогда как контрольные животные за этот же период времени поправились на 21.7 г (табл.1).

Таблица 1

Изменение массы тела у крыс в разные сроки эксперимента до и после интраназального введения пептидов Pro-Leu-Pro, Pro-Leu-Pro-Ala, Pro-Gly-Pro-Ala, Phe-Pro-Leu-Pro-Ala на фоне жировой диеты (М ± m, n=10 в каждой группе)

Примечание: статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля, принятого за 100 %, ** – р< 0.01, * – р< 0.05 (для табл. 1, 2).

Через 1 неделю после отмены применения пептидов у крыс опытных групп замедление роста массы тела продолжалось – все животные поправились всего на 4.1 (4 группа) – 10.2 (1 группа) г по сравнению с исходным весом. Итак, за все время проведения эксперимента животные опытных групп поправились на 14.2 (4 группа), 17.1 (2 группа), 22.5 (3 группа), 23.1(1 группа) г, а крысы контрольной группы поправились на 34.1 г.

Суммарный привес (изменение массы тела за весь период проведения эксперимента) у животных опытных групп был на 32–59 % меньше, чем у контрольной группы, принятой за 100 %. Следовательно, пептиды Pro-Leu-Pro, Pro-Leu-Pro-Ala, Pro-Gly-Pro-Ala и Phe-Pro-Leu-Pro-Ala, применяемые интраназально в ежедневной дозе 50 мкг/кг массы тела на фоне развития метаболического синдрома при одновременном поступлении в организм жирной пищи и глюкозы, замедляли рост массы тела крыс, причем максимальным действием обладал пептид Phe-Pro-Leu-Pro-Ala.

Исследование крови, взятой через 20 ч после последнего 7-го введения пептидов опытным животным, показало, что в контрольной и опытных 1 и 2 группах крыс с метаболическими нарушениями регистрируется повышенный уровень глюкозы по сравнению с нормой. В группе 3 уровень глюкозы был достоверно ниже контроля и соответствовал нормальным значениям (табл. 2).

Таблица 2

Изменение уровня глюкозы в крови и показателей липидного профиля плазмы в разные сроки эксперимента до и после интраназального введения пептидов Pro-Leu-Pro,Pro-Leu-Pro-Ala, Pro-Gly-Pro-Ala,Phe-Pro-Leu-Pro-Alaна модели метаболического синдрома у крыс (М ± m,n=10 в каждой группе)

Примечание: # – р<0,05 по сравнению с нормой.

Через 7 суток после отмены введения пептидов в крови опытных животных 1, 2 и 4 групп наблюдалось достоверное снижение уровня глюкозы на 0.4-1.0 ммоль/л по сравнению с контролем, где содержание крыс на жировой диете и сладкой воде спровоцировало дальнейшие нарушения обменных процессов и рост уровня глюкозы крови. В этот же период времени в опытной группе 3 после отмены применения пептида Pro-Gly-Pro-Ala при содержании крыс на высококалорийном рационе наблюдалось увеличение уровня сахара крови по сравнению с контрольными значениями (табл. 2). На основании полученных данных видно, что гипогликемический эффект после отмены введения пептидов, включающих лейцин и аланин, Pro-Leu-Pro-Ala и Phe-Pro-Leu-Pro-Ala сохранялся в течение недели, а при применении лейцинсодержащего пептида Pro-Leu-Pro этот эффект проявляется впервые лишь спустя неделю после отмены его введения.

На основании проведенного исследования установлено, что пептиды Pro-Leu-Pro-Ala, и Phe-Pro-Leu-Pro-Ala при 7-кратном применении 1 раз в сут в дозе 50 мкг/кг на фоне развития метаболического синдрома оказывали защитное гипогликемическое действие, способствуя поддержанию удовлетворительного уровня глюкозы в крови опытных животных. Спустя неделю после отмены применения препаратов пептиды, включающие лейцин и аланин, сохраняли сниженный уровень глюкозы крови. Это, возможно, обусловлено эффектами, как самих пептидов, так и их составных частей, а именно пептида пролин-лейцин-пролина и аминокислот – лейцина, аланина, которые согласно данным литературы снижают уровень сахара крови до нормальных величин.

После 7-кратного интраназального введения пептидов в опытных группах крыс 2, 3 и 4 происходило достоверное снижение концентрации ОХ с 1.996 ммоль/л (контроль) до 1.536 – 1.600 ммоль/л (на 20–23 %). При этом во всех опытных группах крыс отмечено значительное уменьшение концентрации Хс-ЛПНП с 0.853 ммоль/л (контроль) до 0.530 ммоль/л (на 27–37 % по сравнению с контролем), а также снижение концентрации ТГ – с 2.029 ммоль/л до 1.075 ммоль/л (на 32–47 % по сравнению с контролем).

Таким образом, через 20 ч после введения пептидов животным параметры жирового обмена (ОХ, Хс-ЛПНП, ТГ) у крыс опытных групп приближались к значениям, соответствующим показателям липидного профиля здоровых животных (табл. 2).

Через 7 суток после отмены введения пептидов в плазме крови всех опытных животных концентрация ОХ составила 76–87 % по сравнению с контролем (100 %), что было статистически значимо и близко к нормальным значениям. При этом в плазме крови опытных животных обнаружено достоверное уменьшение концентрации ХС ЛПНП на 14–39 % и концентрации ТГ на 23–60 % по сравнению с контролем, что в опытной группе 4 практически соответствовало показателям у здоровых животных (табл. 2).

Итак, представленные данные указывают на способность пептидов Pro-Leu-Pro, Pro-Leu-Pro-Ala, Pro-Gly-Pro-Ala и Phe-Pro-Leu-Pro-Ala нормализовать параметры жирового обмена в условиях метаболического синдрома, что в конечном итоге должно приводить к уменьшению в крови общего холестерина, атерогенных липопротеинов низкой и очень низкой плотности, а также триглицеридов. Максимальным гиполипидемическим действием обладал пентапептид Phe-Pro-Leu-Pro-Ala. Способность блокировать накопления новых жировых отложений в организме животного, проявляемая в той или иной степени каждым из исследуемых пептидов, была впервые обнаружена нами.

Заключение

На основании проведенного исследования впервые было установлено, что в организме крыс, постоянно употребляющих жирную пищу с избытком насыщенных жирных кислот и глюкозы, интраназальное многократное (7 раз) введение в малых дозах (50 мкг/кг) каждого из исследуемых пептидов восстанавливало нарушенный при развитии метаболического синдрома жировой обмен и приводило к нормализации концентрации глюкозы в крови. Все четыре исследованные пептида при развитии данной патологии замедляли рост массы тела, а максимальный эффект был отмечен при введении пептида Phe-Pro-Leu-Pro-Ala. Следует отметить, что регуляторные пептиды Pro-Leu-Pro-Alaи Phe-Pro-Leu-Pro-Ala оказывали более выраженные эффекты не только через 20 ч после последнего введения животным, но и спустя 7 дней после отмены их введения крысам, которые продолжали находиться на высококалорийной диете, способствующей ожирению и связанному с ним нарушению углеводного и жирового обмена.