Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,006

PHENOTYPIC AND GENOTYPIC ANALYSIS OF TOXINPRODUCTION OF TYPICAL AND ATYPICAL STAMPS OF VIBRIO CHOLERAE IN STRESS ENVIRONMENTAL CONDITIONS

Sizova Yu.V. 1 Pisanov R.V. 1 Vodopyanov A.S. 1 Cherepakhina I.Y. 1 Burlakova O.S. 1
1 The Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Federal Agency on Consumer Rights Protection and Human Welfare Supervision
With the advent of genetically altered variants of V.cholerae, the question arose about the range of variability of phenotypic and genotypic manifestations of toxin production in typical and atypical variants of V.cholerae. In view of the urgency of the problem, experiments have been conducted to assess the effect of stress conditions with which vibrios encounter in the environment the ability to produce cholerogen. As a result of the conducted studies, it was shown that toxigenic V.cholerae can persist in the water of open reservoirs at a temperature of 220С-240С for a sufficiently long period, while preserving the production of cholera toxin, while lowering the temperature to 100C and lower toxin production levels down to negative values. It has been established that ctxAB genes are detected in PCR as long as living vibrios are retained in the population of the strains under study, and no changes in the population of vibrio cells associated with the loss of CTXφ prophage and other significant regions of the genome after low-temperature stress have been observed in our experiments, Which is confirmed in the full genomic sequencing and INDEL-typing of the initial and stressed cultures and speaks of the stability of the genome of V.cholerae under the indicated conditions.
toxinproduction
Vibrio cholerae
atypical stamps

С учетом изменений условий существования холерных вибрионов при смене экологической ниши обитания вопрос о стабильности их генома в условиях стресса остается в настоящее время весьма актуальным, особенно в области признаков, касающихся эпидемической значимости возбудителя холеры. Установлено, что вся эволюция V.cholerae обеспечивается присутствием в геноме мобильных генетических элементов: профагов (CTXφ, RS1φ), островов пандемичности (VSP-I и VSP-II) и патогенности (VPI-1 и VPI-2), а также транспозонов и IS-элементов [4,10,13]. Благодаря данным структурам, в конце прошлого столетия появились генетически измененные варианты V. cholerae биовара Эль Тор с повышенной вирулентностью (так называемые «гибридные» или «атипичные»), несущие в своем геноме ген ctxB1, присущий холерным вибрионам классического биовара. Такие вибрионы с 2001 г. полностью вытеснили типичные штаммы V.cholerae биовара Эль Тор на территории ряда стран Южной Азии (Непал, Индия, Бангладеш, Шри Ланка) и Африки (Мозамбик, Нигерия, Камерун). В 1994 году «атипичные» («гибридные») штаммы вызвали эпидемию холеры в Дагестане, а в 2010–2011 гг. – на о. Гаити [3,10,14]. Однако, несмотря на высокую адаптивную способность холерных вибрионов, не решен вопрос: какие условия требуются для появления и закрепления изменений в геноме возбудителя. Между тем такие сведения крайне необходимы для оптимизации эпидемиологического надзора.

Цель исследования: изучение влияния ряда стрессоров, действию которых вибрионы подвергаются в окружающей среде, на токсинопродукцию.

Материалы и методы: в работе использовали 13 эпидемически значимых штаммов V.cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор (3 – типичные: ctxAB3, rstRElTor, 10 – атипичные: ctxAB1, rstRElTor) и 2 штамма классического биовара, содержащих гены ctxAB1, rstRClass.

Для решения поставленных задач холерные вибрионы инкубировали в стерильной речной воде (конечная концентрация 1*107 м.к./мл) при +40С и при +220С в течение нескольких месяцев, а также (при моделировании условий пребывания возбудителя холеры в речной воде в летнее, осеннее, зимнее время) эксперимент продолжали 2 месяца при 22 0С, 2 месяца – при 10 0С, 5 месяцев – при 4 0С при сниженном содержании кислорода (в речной воде оно составляет около 1 %). Ежемесячно производили высевы на агар Мартена для определения выживаемости холерных вибрионов. Выжившие в условиях стресса клетки культивировали по методике М. Iwanaga [12] для определения продукции холерогена в супернатантах в GM1-ИФА с антитоксической сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов по специально разработанной нами схеме, в рабочем разведении 1х20000. Результаты оценивали при титрации супернатантов по следующей схеме: низкий уровень токсинопродукции – титр в GM1-ИФА 1/2-1/20, средний уровень – 1/40-1/320, высокий уровень – 1/640-1/2560.

Выделение бактериальной ДНК из клеток V. cholerae проводили, согласно МУ 1.3.2569-09 [6]. Полученные образцы, содержащие тотальную ДНК холерного вибриона, использовали для амплификации фрагментов генов. Наличие гена ctxAB определяли в ПЦР[2]. Секвенирование геномной ДНК выполнялись на платформе MiSeq (Illumina). Пробоподготовку проводили согласно протоколам производителя. Сборку контигов осуществляли с помощью программы Velvet [15]. Биоинформационный анализ проводили с помощью программ GeneExpert и SeqAnalyzer, разработанных во ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора с использованием ресурсов геномной базы данных NCBI.INDEL-типирование проводили по методике, предложенной А.С. Водопьяновым [1].

Результаты и обсуждение. Как нами было показано ранее [9], у холерных вибрионов при +4ºС в речной воде в течение первых 14 дней имеет место некоторое увеличение показателей токсинопродукции у большей части исследуемых штаммов (за исключением штаммов V.cholerae 1601 и 17427 – у них отмечалось незначительное снижение титра, и штаммов 569, 1310, 19188, у которых уровень продукции оставался без изменений). Однако уже через месяц стрессового воздействия показатели токсинообразования резко снижались, вплоть до полного исчезновения фенотипического проявления признака к концу второго месяца. Только три штамма V.cholerae ElTor сохраняли способность к токсинопродукции, определяемой методом ИФА: высокотоксигенный типичный 1310, типичный 3119 и атипичный 19667, выделенный от больного в Москве в 2014 г. Остальные 10 штаммов перестали продуцировать холероген, при сохранении генов ctxАВ, определяемых в ПЦР. Через три месяца низкотемпературного стресса ни одна из культур не выросла в среде AKI, показатели токсинопродукции были отрицательными, гены ctxAB в ПЦР не обнаружены.

Обращает на себя внимание, что реакция на стрессовое воздействие разных температур, имитирующих условия пребывания холерных вибрионов в речной воде, отличалась у типичных и атипичных вариантов. Так, средние показатели токсинопродукции при холодовом стрессе (4°С) у атипичных вариантов были выше только в первые две недели (рис. 1), затем уровень холерогена у них снижался интенсивнее, чем у типичных штаммов (показания высокотоксигенного исходного мутантного штамма 1310 в расчет не принимались), т.е. они были более чувствительны к низким температурам, чем типичные.

Рис. 1. Средние показатели токсинопродукции при длительной инкубации типичных и атипичных холерных вибрионов в речной воде при 4°С

Напротив, в отсутствие температурного стресса (22°С) средние показатели токсинопродукции у атипичных вариантов вибрионов Эль Тор на всем протяжении исследования были в 2–8 раз выше, чем у типичных штаммов, что в полной мере характеризует их, как варианты с повышенной вирулентностью (рис. 2).

Рис. 2. Средние показатели токсинопродукции при длительной инкубации типичных и атипичных холерных вибрионов в речной воде при 22°С

Рис. 3. Средние показатели токсинопродукции при длительной инкубации типичных и атипичных холерных вибрионов в речной воде при постепенной смене температур

При моделировании условий пребывания холерных вибрионов в водоемах Российской Федерации, в которых на протяжении эпидемического сезона температура постепенно снижается, токсинопродукция к 5 месяцу инкубации практически отсутствовала, но на протяжении 4 летне-осенних месяцев при 22°С и 10°С она в среднем в 2–4 раза была выше у атипичных вариантов (рис. 3), что необходимо учитывать при проведении эпиднадзора за холерой. Проведенные исследования показали, что фенотип возбудителя холеры в части токсинопродукции выраженно «отвечает» на стрессовые воздействия окружающей среды.

Что касается структуры генома, то в эксперименте Т.А. Кульшань с соавторами была показана возможность утраты генов профага СТХφ, в том случае, когда исследуемые «типичные» штаммы холерных вибрионов несли одну копию профага, в то время как атипичные «гибридные» геноварианты с двумя копиями профага СТХφ сохраняли указанные гены [5]. В наших опытах в ПЦР отмечено сохранение генов патогенности вне зависимости от отрицательных показателей ИФА, до тех пор, пока в популяции исследуемых штаммов сохранялись живые вибрионы. В «пустых» пробах, исследуемых после гибели всей популяции V.cholerae, гены, ответственные за токсинопродукцию, не обнаруживались.

В свете полученных данных представляло интерес сравнить геномы исходных и стрессированных вариантов холерных вибрионов, для чего было проведено полногеномное секвенирование 3 штаммов, а также сравнение их INDEL-профилей по 9 локусам (табл.1,2).

В таблице 1 представлены результаты сиквенса, выраженные в процентах совпадения с референс-последовательностью.

Таблица 1

Результаты полногеномного секвенирования исходных и стрессированных культур холерных вибрионов

Анализируемые гены

V.choleraeElTor

19241 (301)

морская вода, 2011г

V.choleraeElTor

5879

больной, 1972г

V.cholerae classical

569

больной, 1968

исходный

стресс

исходный

стресс

исходный

стресс

Принадлежность

к виду V. cholerae

ompW (VCA0867)

100,00

100,00

100,00

100,00

99,16

99,16

Коллагеназа(VC1650)

99,74

99,70

99,80

99,80

99,21

99,21

VCA0164

100,00

100,00

100,00

100,00

98,1

98,1

Серогруппа

О1 (ген wbe)

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

Биовары

hlyA Eltor

100,00

100,00

100,00

100,00

98,9

98,9

hlyA classical

94,6

94,6

97,6

97,6

100,00

100,00

rtxCElTor(VC1450)

100,00

100,00

100,00

100,00

-

-

Профаг CTX

cep (VC1461)

100,00

100,00

100,00

100,00

98,00

98,00

orfU (VC1460)

100,00

100,00

100,00

100,00

96,1

96,1

ace (VC1459)

100,00

100,00

100,00

100,00

98,6

98,6

zot (VC1458)

100,00

100,00

100,00

100,00

98,8

98,8

ctxA (VC1457)

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

ctxB1 (Classical)

100,00

100,00

100,00

100,00

99,47

99,47

ctxB3 (El Tor)

99,47

99,47

100,00

100,00

-

-

Профаг RSI

RstR (VC1464)

100,00

100,00

100,00

100,00

-

-

RstA (VC1454)

99,63

100,00

98,81

98,81

98,8

98,8

rstС (VC1452)

100,00

100,00

100,00

100,00

-

-

rstRElТor(VC1455)

100,00

100,00

100,00

100,00

-

-

Остров патогенности VPI-I

aldA (VC0819)

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

mop (VC0823)

100,00

100,00

100,00

100,00

97,7

97,7

tcpA (VC0828)

99,85

99,85

100,00

100,00

80,4

80,4

toxT (VC0838)

100,00

100,00

100,00

100,00

99,88

99,88

acfB (VC0840)

100,00

100,00

100,00

100,00

99,89

99,89

Остров патогенности VPI-II

VC1757

100,00

100,00

100,00

100,00

99,90

99,90

VC1810

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

nanH (VC1784)

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

VC1803

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

Остров пандемичности VSP-I

VC0175

100,00

100,00

100,00

100,00

-

-

VC0178

100,00

100,00

100,00

100,00

-

-

VC0180

99,93

100,00

100,00

100,00

-

-

VC0183

100,00

100,00

100,00

100,00

-

-

VC0185

100,00

100,00

100,00

100,00

-

-

Остров пандемичности VSP-II

VC0490

100,00

100,00

100,00

100,00

-

-

VC0496

-

-

100,00

100,00

-

-

type IV pilin (VC0502)

-

-

100,00

100,00

-

-

Кластер RTX

RTX toxin RtxA (VC1451)

100,00

100,00

100,00

100,00

-

-

RTX toxin transporter (VC1447)

100,00

100,00

100,00

100,00

99,86

99,93

Кластер MSHA

mshA (VC0409)

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

proteinCsrD (VC0398)

99,85

99,85

99,80

99,80

99,85

99,85

MSHA pilin protein MshD (VC0411)

100,00

100,00

99,84

99,84

100,00

100,00

Система секреции шестого типа (T6SS)

vasA (VCA0110)

100,00

100,00

100,00

100,00

99,44

99,44

vasF (VCA0115)

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

vasK (VCA0120)

100,00

100,00

100,00

100,00

99,87

99,87

vgrG3 (VCA0123)

100,00

100,00

100,00

100,00

99,93

99,93

Tol-кластер

и локус vps

tolQ (VC1839)

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

TolA (VC1837)

100,00

100,00

99,91

100,00

100,00

100,00

TolR (VC1838)

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

vpsA (VC0917)

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

vpsL (VC0934)

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

100,00

 

ToxT

100,00

100,00

100,00

100,00

80,40

80,40

ToxR

99,66

99,66

100,00

100,00

99,84

99,84

ToxS

100,00

100,00

100,00

100,00

99,89

99,89

 

Как видно из таблицы, полногеномное секвенирование стрессированных культур не выявило полиморфизма структуры генома в сравнении с исходными штаммами по основным наборам генов.

В связи с тем, что в литературе есть сведения об изменениях VNTR-профиля холерных вибрионов на начальном этапе стрессового воздействия у отдельных штаммов, которые рассматриваются авторами как первичная реакция на стресс [7], вероятно, следует учитывать их при анализе результатов молекулярного типирования вибрионов, выделенных в рамках проведения мониторинга при эпидемиологическом надзоре за холерой. В связи с этим возникала необходимость выбора более стабильного метода типирования выделяемых штаммов холерных вибрионов, в том числе разработанного А.С. Водопьяновым INDEL-типирование [1]. Проведение INDEL-типирования исследуемых штаммов по 9 локусам показало, что все изученные стрессированные культуры сохранили свой INDEL-профиль без изменений (табл. 2).

Таблица 2

Результаты INDEL-типирования исходных и стрессированных культур холерных вибрионов

п/п

№ штамма

Дата выде-ления

Место выделения

Источник выделения

ctx

tcp

INDEL-аллель по локусам

CoA

OmpU

hutG

2456

122

704

3186

CheA

p1070

1

19241/

301

2011

г.Таганрог

морская вода

+

+

98

166

159

78

79

77

67

169

67

 

19241-1

стрессир.1

+

+

98

166

159

78

79

77

67

169

67

 

19241-2

стрессир.2

+

+

98

166

159

78

79

77

67

169

67

2

5879

1972

г. Таганрог

больной

+

+

98

166

159

78

79

77

67

169

67

 

5879-1

стрессир.1

+

+

98

166

159

78

79

77

67

169

67

 

5879-2

стрессир.2

+

+

98

166

159

78

79

77

67

169

67

3

569В

(классич.)

1968

Индия

больной

+

+

98

166

159

87

79

77

67

169

80

 

569В -1

стрессир.1

+

+

98

166

159

87

79

77

67

169

80

 

569В -2

стрессир.2

+

+

98

166

159

87

79

77

67

169

80

 

Выводы. Таким образом, токсигенные холерные вибрионы могут персистировать в воде открытых водоемов при температуре 22°С-24°С достаточно продолжительный срок с сохранением продукции холерного токсина, т.е. оставаясь эпидемически значимыми; при понижении температуры до 10°С и ниже уровни токсинопродукции снижаются вплоть до отрицательных значений, а низкая температура как стрессор, имитирующий условия окружающей среды в речной воде в холодное время года, возможно, ингибирует активацию белка ToxT, ответственного за транскрипцию генов, кодирующий холерный токсин, уже в первый месяц. Установлено, что, вне зависимости от отрицательных показателей ИФА, гены ctхAB обнаруживаются в ПЦР до тех пор, пока в популяции исследуемых штаммов сохраняются живые вибрионы. В «пустых» пробах, исследуемых после гибели всей популяции V.cholerae, гены, ответственные за токсинопродукцию, не обнаруживаются. Изменений в популяции клеток вибрионов, выживших после низкотемпературного стресса, связанных с утратой профага CTXφ, несущего гены, ответственные за синтез холерного токсина, а также утратой других значимых участков генома, в наших экспериментах не отмечено, что подтверждается в полногеномном секвенировании INDEL-типировании исходных и стрессированных культур и говорит о его стабильности. Возможно, изменение токсинопродукции в стрессовых условиях связано не с реорганизацией генома, а с изменением экспрессии каскада регуляторных генов ToxR-S, ToxT, регуляция которых находится в непосредственной зависимости от состояния кворум сенсинга бактериальной культуры V.cholerae и управляется четырьмя малыми РНК, получившими название Qrr1-4 [8]. Возможно, регуляторная система малых РНК позволяет V.cholerae сохранять гены патогенности в стрессовых условиях, что и является предметом наших дальнейших исследований.