Все большее внимание исследователей привлекает проблема нарушения нейроиммуноэндокринного гомеостаза и возможности его коррекции при различных патологических состояниях. Данные многочисленных экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о развитии целого комплекса нарушений в условиях гипоэстрогенемии, в том числе наблюдается нарушение психоневрологического статуса и дисфункция иммунной системы [1-5]. Формирование тревожно-депрессивных расстройств, снижение когнитивных функций, нарушение процессов обучения и памяти, повышение частоты развития нейродегенеративных заболеваний при депривации эстрогенов обусловлены тем, что эстрогены непосредственно участвуют в процессах нейрогенеза, нейропротекции, в регуляции поведенческой и нейроэндокринной функций центральной нервной системы, модулируют функциональное состояние ядер гипоталамуса, гормонпродуцирующую функцию аденогипофиза и т.д. [3, 5-7]. О важности влияния эстрогенов на активность клеток ЦНС свидетельствует высокий уровень эстрадиола в ЦНС, который поддерживается не только за счет циркулирующих гормонов, но и локального синтеза эстрадиола с помощью ароматазы, содержащейся в мозге в большом количестве [3, 6].

С другой стороны, хорошо известна важная роль нейроэндокринной регуляции в процессах иммуногенеза. В условиях депривации эстрогенов нарушается функциональная активность фагоцитов – клеток, которые не только обеспечивают первую линию защиты организма от повреждающих факторов внешней среды, противоинфекционную и противоопухолевую резистентность, процессы иммуногенеза, участвуют в нейроэндокринной регуляции адаптивных реакций, но и чутко реагируют на малейшие изменения физиологического состояния организма [2,4,5,8,9,11]. Это позволяет использовать фагоцитарные реакции в качестве интегрального показателя состояния иммунной системы [4,11,12].

В связи с вышеизложенным представляет интерес возможность коррекции нейроиммуноэндокринных нарушений психотропными препаратами с иммунотропной активностью. Нами изучено влияние кортексина, обладающего нейропротекторным и иммуномодулирующим действием [7,13], на защитную активность полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) и перитонеальных макрофагов (ПМФ) у овариэктомированных самок крыс.

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на 60 белых половозрелых неинбредных крысах-самках массой 180-200 г. Двухстороннюю овариэктомию проводили под легким эфирным наркозом [5]. Ложнооперированным животным производился аналогичный доступ без удаления яичников. Контроль за эффективностью кастрации осуществляли микроскопией влагалищных мазков на протяжении трех недель. В течение всего периода наблюдения клеточный состав мазков оставался неизменным и соответствовал фазе межтечки.

Животные были разделены на 4 группы: 1-я группа - контроль (интактные животные), 2-я группа – ложнооперированные животные (Ложн/опер), 3-я группа – овариэктомированные животные (Овар/эк) и 4-я группа - овариэктомированные животные, получавшие кортексин (ООО «ГЕРОФАРМ», Россия, г. Санкт-Петербург) (Овар/эк+Корт) в дозе 1 мг/кг внутримышечно в течение 10 дней [14], считая нулевым днем окончание 3-недельного срока наблюдения после операции.

Животные содержались в стандартных условиях вивария с естественным световым режимом, на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТР 50258-92), с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96) и согласно Приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP).

Определяли количество лейкоцитов в периферической крови, интенсивность кислородзависимого метаболизма (спонтанный и индуцированный НСТ-тест), антимикробную активность ПМЯЛ и ПМФ в условиях функционирования и блокады (азидом натрия) кислородзависимых факторов микробицидности в отношении грибов Candida albicans, активность миелопероксидазы (МП) и содержание катионных белков (КБ) в ПМЯЛ и ПМФ [15].

Результаты НСТ-теста оценивали после 30 минут инкубации суспензии ПМЯЛ в 0,1%-ном растворе нитросинего тетразолия (Chemapol) морфологическим методом. В мазках определяли процент активных клеток (содержащих гранулы восстановленного диформазана) и индекс активации (степень активации в перераспределении на 1 фагоцит). Показатели вычисляли для интактной суспензии фагоцитов (спонтанный НСТ-тест) и в процессе фагоцитоза частиц латекса (индуцированный НСТ-тест).

Антимикробную активность определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) микробов (С. albicans, штамм 2), выросших через 3 суток на среде высева. Контролем служил высев микроба из среды реакции, не содержащей фагоцитирующих клеток (ПМЯЛ, ПМФ). Инактивирующую активность фагоцитов выражали в процентах микробных клеток, инактивированных фагоцитами (индекс инактивации, ИИ).

Активность МП и КБ оценивали по интенсивности окраски (пользуясь 5-балльной шкалой), вычисляли процент активных клеток в мазке (ПА) и средний цитохимический коэффициент (СЦК) по G. Astaldi, L. Verga: СЦК=(1а+2в+3с+4d) / 100, где 0-4 – интенсивность окраски, а, в, с, d – количество ПМЯЛ (ПМФ) с соответствующей интенсивностью окраски [8]. Результаты регистрировали на следующий день после окончания введения кортексина (11-е сутки).

Статистическую обработку проводили с использованием методов вариационной статистики [16], пакета программ Statistica 8.0. Проверку на нормальность распределения данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Вилка. Оценку значимости различий проводили, вычисляя медиану и межквартильный интервал. Дисперсионный анализ проводили с помощью Н-критерия Краскела-Уоллиса, для множественных сравнений использован Q-критерий Дана. Критический уровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05. Данные в тексте представлены в процентах к контролю (неинбредные животные).

Результаты и обсуждение

У овариэктомированных животных на 32-й день после операции было выявлено снижение числа лейкоцитов в периферической крови (до 71,74% по отношению к контролю) (рис. 1). Наблюдалось подавление оксидантных механизмов микробицидности. Об этом свидетельствовало увеличение числа КОЕ C. albicans (до 139,19%, p=0,0003), сопровождавшееся снижением активности МП в ПМЯЛ и интенсивности кислородзависимого метаболизма этих клеток. Так, процент МП-положительных клеток составил 61,54% (p=0,0292), а СЦК – 59,70% (p=0,0050), т.е. почти на 40% по сравнению с аналогичными показателями у интактных и ложнооперированных животных (рис. 2 А, Б).

Рис. 1. Влияние кортексина на содержание лейкоцитов у экспериментальных животных в условиях овариэктомии

Также наблюдалось снижение интенсивности образования активных форм кислорода (АФК), не достигавшее, однако, статистической значимости (индуцированный НСТ-тест): процент активных клеток составил 85,71%, а индекс активации – 72,22%. В результате ИИ ПМЯЛ в группе Овар/эк составил 79,65%. Полученные данные свидетельствуют о нарушении активности как пероксидазозависимых, так и пероксидазонезависимых механизмов микробицидности нейтрофильных гранулоцитов в условиях гипоэстрогенемии, а также при воздействии других повреждающих факторов, что согласуется с данными других авторов [1,2,4,17].

Выявлено подавление неоксидантных факторов микробицидности ПМЯЛ у овариэктомированных животных: число КОЕ возросло до 136,52% (p=0,0097), в результате чего ИИ составил 69,53%. Это сопровождалось снижением содержания КБ в ПМЯЛ: процент КБ-позитивных клеток уменьшился в 4 раза (до 24,31% по сравнению с интактными (p=0,008) и ложнооперированными животными (p=0,00002)) (рис. 3 А, Б).

 А   Б

Рис. 2. Влияние кортексина на активность миелопероксидазы в ПМЯЛ у экспериментальных животных в условиях овариэктомии: А – процент активных клеток, Б – средний цитохимический коэффициент

  А   Б

Рис. 3. Влияние кортексина на содержание катионных белков в ПМЯЛ у экспериментальных животных в условиях овариэктомии: А – процент активных клеток, Б – средний цитохимический коэффициент

У овариэктомированных крыс наблюдалось падение фунгицидной активности мононуклеарных фагоцитов в условиях как функционирования, так и блокады кислородзависимых факторов биоцидности, не достигавшее, однако, статистической значимости (ИИ составил 61,84% и 59,95% соответственно). Это сопровождалось значительным подавлением интенсивности кислородзависимого метаболизма ПМФ (индуцированный НСТ-тест): процент активных клеток снизился до 67,24% (p=0,0084 по сравнению с интактными животными и p=0,0013 по сравнению с группой ложнооперированных крыс), индекс активации – до 64,52% (p=0,0288 по сравнению с контролем и p=0,0013 по сравнению с группой Ложн/опер). При цитохимическом исследовании не было выявлено снижения активности МП и КБ в ПМФ. Полученные данные свидетельствуют о подавлении пероксидазонезависимых оксидантных факторов биоцидности мононуклеарных фагоцитов в условиях депривации эстрогенов, что согласуется с известными данными об активирующем влиянии эстрогенов на функциональную активность макрофагов и подавление ИЛ-1 [4,18].

Применение кортексина полностью устраняло лейкопению, вызванную овариэктомией (рис. 1). Также восстанавливалась активность оксидантных механизмов киллинга ПМЯЛ: число КОЕ снизилось до 120,27% (p=0,6805), ИИ составил 91,52%. Важно отметить, что использование кортексина восстанавливало активность МП в ПМЯЛ: процент МП-позитивных клеток составил 105,13% (p=1,0000 при сравнении с контролем, и p=0,0378 при сравнении с группой овариэктомированных животных), а СЦК - 98,51% (по отношению к интактным животным, p=1,0000) (рис. 2 А, Б). Кортексин повышал (достоверно по отношению к группе овариэктомированных крыс) активность пероксидазонезависимых микробицидных систем ПМЯЛ, о чем свидетельствовало увеличение образования АФК (индуцированный НСТ-тест): процент активных клеток составил 117,86% (p=1,0000 по сравнению с интактными животными и p=0,0189 по сравнению с группой овариэктомированных крыс), индекс активации – 116,67% (p=0,5545 по сравнению с контролем и p=0,0005 по сравнению с группой овариэктомированных крыс). Следовательно, кортексин нормализовал активность как пероксидазозависимых, так и пероксидазонезависимых микробицидных систем нейтрофилов при гипоэстрогенемии.

Вместе с тем кортексин не устранял депрессию неоксидантных механизмов фунгицидности ПМЯЛ - ИИ составил 73,67% (КОЕ – 131,56%, p=0,2978). Об этом же свидетельствовал и сохраняющийся низкий уровень КБ в ПМЯЛ (рис. 3 А, Б).

В группе овариэктомированных крыс, получавших кортексин, активность оксидантных микробицидных систем ПМФ не отличалась от таковой у интактных и ложнооперированных животных, о чем свидетельствовало уменьшение числа КОЕ (до 113,91% (p=1,0000 по сравнению с контролем и p=1,0000 по сравнению с группой ложнооперированных животных). Это сопровождалось полным восстановлением продукции АФК мононуклеарными фагоцитами (индуцированный НСТ-тест): процент активных клеток составил 82,76% (p=0,3662 по сравнению с интактными животными и p=0,0687 по сравнению с группой ложнооперированных крыс), индекс активации – 87,10% (p=1,0000 по сравнению с контролем и p=0,1904 по сравнению с группой ложнооперированных животных). Активность МП в макрофагах не отличалась от таковой у интактных животных.

Применение кортексина статистически значимо (по сравнению с группами ложнооперированных и овариэктомированных животных) повышало активность неоксидантных механизмов микробицидности ПМФ: число КОЕ составило 68,42% (p=0,0019 по сравнению с группой ложнооперированных животных и p=0,00002 по сравнению с группой овариэктомированных крыс), ИИ возрос почти на 50% по сравнению с группой овариэктомированных животных и на 30% - по сравнению с группой ложнооперированных крыс и составил 118,37% (по отношению к контролю).

Выводы

Таким образом, использование кортексина существенно уменьшает негативное влияние овариэктомии на количественные и качественные показатели функциональной активности фагоцитов: устраняет лейкопению, восстанавливает интенсивность кислородзависимого метаболизма, активность оксидантных микробицидных систем. Полученные данные подтверждают взаимозависимость состояния иммунной и эндокринной систем и обосновывают необходимость дальнейшего поиска возможных путей фармакологической коррекции нарушений иммуно-эндокринного гомеостаза в условиях гипоэстрогенемии.