Общеизвестно, что метаболический синдром (МС) представляет собой комплекс метаболических, гормональных и клинических нарушений, к основным признакам которого относятся абдоминально-висцеральное ожирение, нарушение метаболизма глюкозы и инсулина, инсулинорезистентность, дислипидемия, повышение уровня триглицеридов крови, артериальная гипертензия [1]. Также МС сопровождается эндотелиальной дисфункцией, прогрессирование которой может приводить к повышению свертываемости крови, развитию атеросклеротических изменений в сосудах и тромбозам [2].

К настоящему времени метаболическая терапия представлена целым рядом препаратов (статины, фибраты, ингибиторы β-окисления жирных кислот и др.), воздействующих практически на все стадии метаболизма липидов [3]. Кроме того, известны немногочисленные средства пептидной и аминокислотной природы [4,5]. Дополнительно с целью коррекции нарушенных функций свертывающей и противосвертывающей систем крови при этом заболевании  проводят   антитромботическую терапию [6].  В связи с этим, актуальность поиска препаратов, в действии которых сочетаются антитромботические и липолитические свойства,  не вызывает сомнений [6,7].

 Известно, что при нарушении гомеостатического баланса в организме немаловажная роль принадлежит пептидэргической регуляции [8]. К пептидным биорегуляторам относятся глицин- и пролинсодержащие олигопептиды – глипролины [9], которые, обладая широким спектром биологической активности, участвуют в сохранении нормальной функциональной активности свертывающей и противосвертывающей систем организма и положительно влияют на липидный и углеводный обмен [10]. Известно также, что некоторые аминокислоты, такие как пролин, лизин, аргинин, лейцин, снижают риск развития атеротромбоза, сахарного диабета и атеросклероза, предотвращая отложение преатерогенного холестерина липопротеидов низкой плотности на стенках артерий [5]. Аргинин способствует появлению в кровотоке оксида азота, обеспечивающего гиполипидемический, гипогликемический и противосвертывающий эффекты [11,12]. Мы предположили, что введение аргинина в молекулу глипролина может улучшить корригирующее действие физиологически активных коротких пептидов на ключевые звенья патогенеза МС.

Цель исследования – изучение противосвертывающего, гипогликемического и гиполипидемического действия аргининсодержащих глипролинов Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro у крыс в условиях экспериментального метаболического синдрома.

Материалы и методы исследования

В работе применяли пептиды Pro-Arg-Gly (PRG) и Gly-Arg-Pro (GRP), синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН.

Эксперименты были проведены на самцах белых беспородных крыс массой тела 300–350 г с соблюдением этических принципов Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 15.06.2006). Для развития метаболических нарушений животные в течение 6-ти недель находились на высококалорийной диете (ВКД), содержащей избыточное количество углеводов, жиров и насыщенных жирных кислот (маргарин, плавленый сыр, свиное сало и др.). В качестве питья животные получали 10 % раствор глюкозы. Калорийность ВКД составляла не менее 3500 ккал/кг. Через 6 недель при продолжающемся получении ВКД животные были разделены на 3 группы – 2 опытные (Опыт), получавшие интраназально 1 раз в сутки ежедневно в течение 5 суток PRG или GRP в дозе 1 мг/кг и контрольную (Контроль), получавшую в те же сроки и тем же способом 0.85 % раствор NaCl. Дополнительно в экспериментах использовали нормальных здоровых крыс (Норма), которые содержались на стандартном гранулированном комбикорме (Лабораторкорм, 2950 ккал/кг) и не получали никаких препаратов. В каждой группе было по 12 животных. 

Образцы крови получали через 1 час после последнего введения пептидов (или 0.85 % раствора NaCl) и через 7 суток после прекращения применения препаратов при продолжающемся содержании животных на ВКД.  Взятие крови осуществляли  из v. jugularis с использованием в качестве консерванта 3.8 % раствора  цитрата  натрия в соотношении кровь : консервант как 9 : 1.

В цельной крови определяли концентрацию глюкозы на биохимическом анализаторе «One Touch Horison» (США) с использованием тест-полосок; в плазме крови – показатели суммарной (СФА) и неферментативной (НФА) фибринолитической активности на нестабилизированных пластинах фибрина, антикоагулянтную активность по тесту активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), агрегацию тромбоцитов (АТ), индуцированную АДФ [13], концентрацию триглицеридов энзиматическим калориметрическим методом с использованием набора реагентов фирмы «Ольвекс-Диагностикум» (Россия).    

Статистическая обработка полученных данных проводилась по методу Стьюдента и с использованием непараметрических статистических критериев.

Результаты и их обсуждение

Эксперименты показали, что содержание крыс на ВКД, обогащенной жирами и углеводами, в течение 6-ти недель приводило к развитию нарушений липидного и углеводного обмена: в плазме крови животных наблюдалось достоверное повышение концентрации ТГ на 84 % и глюкозы крови в 3 раза по сравнению с группой Норма (табл.1). По параметрам гемостаза у контрольной группы (животные на ВКД) отмечалась гиперкоагуляция: достоверно повысилась свертываемость крови по данным АЧТВ на 10 %, снизился фибринолиз по тестам СФА и НФА на 19 % и 15 % по сравнению с Нормой соответственно. При этом агрегация тромбоцитов в крови контрольных крыс повысилась на 30 % по сравнению с нормальными значениями.

Таблица 1

Биохимические параметры крови крыс с метаболическим синдромом (МС)  через 1 ч после многократного интраназального введения PRG или GRP (М±m) 

Примечание: здесь и в табл. 2: * – p < 0.05, ** – p < 0.01 по cравнению с нормой; ## – p < 0.01 по сравнению с контролем.

Полученные данные свидетельствовали о развитии МС в организме крыс, с которыми в дальнейшем проводились эксперименты по изучению действия пептидов на липидный обмен, уровень глюкозы  крови и систему гемостаза.

Было установлено, что 5-кратное интраназальное введение пептидов PRG и GRP на фоне ВКД приводило к усилению антитромбоцитарных и антикоагулянтных свойств плазмы крови опытных животных. Так, через 1 час после последнего введения PRG или GRP в крови животных наблюдалось достоверное снижение АТ на 23 % и 39 % по сравнению с контрольными значениями соответственно (табл. 1). Сниженный уровень АТ сохранялся и через 7 сут после прекращения применения обоих пептидов на фоне продолжающегося содержания крыс на ВКД (табл. 2).  Время образования сгустка по тесту АЧТВ в опытных группах при введении пептида PRG достоверно удлинялось как через 1 час, так и через 7 сут после последнего введения, на 18 % и 24 % относительно контрольных значений соответственно. Введение GRP вызывало недостоверное удлинение времени образования сгустка на 7–8 % по сравнению с контролем (табл. 1, 2). 

Таблица 2

Биохимические параметры крови крыс с метаболическим синдромом (МС) через 7 сут после прекращения интраназального введения PRG или GRP (М±m)

Примечание: # – p < 0.05 по сравнению с контролем.

Наряду с увеличением антикоагулянтной и антитромбоцитарной активности исследуемые пептиды вызывали возрастание показателей фибринолитической системы плазмы крови животных с МС. Введение PRG приводило к незначительному увеличению СФА через 1 час после введения, тогда как применение пептида GRP вызывало достоверное увеличение СФА на 23 % по сравнению с контролем. Следует отметить, что введение и пептида PRG, и пептида GRP вызывало повышение НФА плазмы крови животных, но эти отличия от контрольных значений (на 8–9 %) носили недостоверный характер (табл. 1). Через 7 сут после прекращения применения обоих пептидов наблюдалось еще более выраженное относительно контроля повышение СФА на 43 % и 31 % за счет увеличения НФА на 31 % и 20 % после применения PRG и   GRP соответственно (табл. 2).

Таким образом, пептиды PRG и GRP при многократном интраназальном введении крысам с экспериментальным МС способствовали усилению антикоагулянтно-фибринолитического фона плазмы крови и снижали АДФ-вызванную агрегацию тромбоцитов. Показатели гемостаза опытных животных приближались к значениям параметров у здоровых крыс или даже превышали таковые.

Многократное интраназальное введение пептидов PRG и GRP (через 1 час после введения) вызывало значительное достоверное снижение уровня глюкозы крови на 57–60 % концентрации ТГ на 65–68 % относительно контроля (табл. 1).  Гипогликемическое и гиполипидемическое действие исследованных пептидов, хотя и менее выраженное, сохранялось и через 7 сут после прекращения их применения (табл. 2). Следовательно, пептиды PRG и GRP проявляли гипогликемический и гиполипидемический эффекты в организме животных на фоне такой патологии, как МС.

Из анализа полученных данных можно утверждать, что содержание крыс на ВКД, обогащенной жирами и углеводами, приводило к нарушениям углеводного и липидного обменов веществ, в результате чего в крови повышалось содержание триглицеридов и глюкозы крови, что согласуется с ранее полученными данными [10]. Наряду с этим у таких животных отмечалось увеличение свертываемости крови, что выражалось в снижении антиагрегационных, антикоагулянтных и фибринолитических свойств крови. Возможно, это связано с жировым перерождением артериальной стенки, развитием дисфункции эндотелия, повышением уровня факторов свертывания, в том числе тканевого фактора, с последующим развитием гиперкоагуляции [14]. Эти признаки характеризуют развитие у экспериментальных животных МС, являющегося комплексным заболеванием, затрагивающим многие системы организма [1].

Исследованные препараты пептидов в этих условиях способствовали восстановлению нормальных значений показателей глюкозы и триглицеридов крови. Это может быть обусловлено как антилипемическим и гипогликемическим действием самих пептидов, так и эффектами аминокислот, входящих в состав пептидов [5]. Возможно, исследованные пептиды способствуют, подобно природному антикоагулянту гепарину, активации липопротеидной липазы крови и уменьшению инсулинорезистентности с последующим снижением атерогенных свойств крови и нормализации уровня глюкозы [10,13].

Противосвертывающие эффекты исследованных пептидов обусловлены способностью глипролинов вызывать эндотелий-зависимую реакцию выброса в кровоток активатора плазминогена и ингибировать активность тромбина [9]. Кроме того, антиагрегационное действие исследуемых пептидов может быть обусловлено и наличием в структуре PRG и GRP аргинина, который может проявлять антиагрегационные свойства, поскольку является предшественником оксида азота [11]. Также известно, что под влиянием ряда коротких пептидов происходит усиление экспрессии генов к антитромбину III, протеину С и ТАП, а также супрессия генов тканевого фактора, в результате чего уменьшается гиперкоагуляция и стимулируется фибринолиз [14]. 

Заключение

Таким образом, в условиях моделирования метаболического синдрома у крыс исследованные нами аргининсодержащие пептиды PRG и GRP обладают сочетанным действием на систему гемостаза, параметры липидного обмена и содержание глюкозы в крови. Введение PRG и GRP крысам с развившимся МС приводило к нормализации антикоагулянтно-фибринолитических и антиагрегационных по отношению к тромбоцитам свойств крови, а также снижению триглицеридов и глюкозы крови. Наиболее выраженным и пролонгированным действием в организме обладал пептид PRG. В перспективе эти регуляторные пептиды могут быть отнесены к терапевтическим средствам, которые одновременно обладают противосвертывающим, гипогликемическим и гиполипидемическим действием при метаболических нарушениях в организме.