Профилактика и терапия постреанимационных осложнений, полноценное восстановление после тяжелой ишемии является одной из важнейших задач фундаментальной медицины. Внезапная остановка кровообращения вызывает развитие тотальной гипоксии/аноксии и достаточно стереотипные для биологических систем метаболические сдвиги [1]. Несмотря на универсальность системного ответа, степень повреждения и возможности восстановления организма после гипоксического воздействия чрезвычайно вариабельны. Известно, что эволюционно сформировавшаяся норма реакции на гипоксию отличается даже у животных одного вида и пола, что находит отражение в особенностях индивидуальной резистентности к гипоксии, в том числе в характере адаптивных поведенческих реакций. С позиций теории адаптационных стратегий адаптация к экстремальным воздействиям может быть направлена на активное преодоление действия патогенного фактора за счет реализации реакции «борьба-бегство», что является основой резистентной стратегии, либо на пассивное восприятие действия раздражителя – толерантная стратегия [2]. Две полярные стратегии отличаются друг от друга своими механизмами, а также адаптивными и дезадаптивными последствиями. Толерантная стратегия адаптации характеризуется ограничением потребления кислорода и повышенной устойчивостью к гипоксии. Напротив, для резистентной стратегии характерно сниженное потребление кислорода и нарушение устойчивости к гипоксии. Глюкокортикоиды в процессах приспособления организма к экстремальным воздействиям играют важнейшую роль, выполняя множество препаративных функций, реализуемых через специфические кортикостероидные рецепторы. Именно изменение экспрессии центральных глюкокортикоидных рецепторов считается ответственным за трансформацию активности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы и поведенческой адаптации при воздействии стрессора [3].

Цель работы – экспериментальное исследование взаимосвязей между уровнями кортикостерона в плазме крови, экспрессии глюкокортикоидных и минералокортикоидных рецепторов гиппокампа и поведенческой активности крыс с разной устойчивостью к гипоксии после перенесенной глобальной ишемии.

Материалы и методы. Серия экспериментов выполнена на 320 половозрелых самцах беспородных белых крыс массой 180-220 г. При выполнении экспериментальных исследований руководствовались этическими принципами, декларированными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г.). Животных содержали на стандартном рационе вивария при свободном доступе к воде. Условия проведения экспериментов для контрольных и опытных групп были идентичными.

По итогам тестирования на устойчивость к гипоксии [4] животные были разделены на две группы: высокоустойчивые (ВУ) и неустойчивые (НУ) к гипоксии. Через неделю после тестирования под общим эфирным наркозом моделировали 5-минутную аноксию по методу Корпачева В.Г. (1982) [5] интраторакальным пережатием сосудистого пучка сердца с последующей реанимацией. Контрольная группа крыс после тестирования на устойчивость к гипоксии подвергалась эфирному наркозу без моделирования аноксии. Период наблюдения составлял 35 дней. По истечении 1, 3, 5, 7, 14, 21 и 35-х суток животных под эфирным наркозом выводили из эксперимента декапитацией и осуществляли забор крови и ткани мозга для исследования. Содержание глюко- и минералокортикоидных рецепторов в гиппокампе крыс определяли методом иммуноферментного анализа с использованием стандартных тест-систем ELISA Kit (China) фирмы Cloud-Clone Сorp. (USA), циркулирующего кортикостерона – радиоиммунологическим методом с помощью стандартных тест-систем IMMUNOTECH (Чехия).

В каждый контрольный отрезок времени оценивали характер поведения животных с использованием теста «открытое поле» (ОП). Все паттерны систематизировали, после чего выделяли следующие интегральные характеристики индивидуального поведения: эмоциональная тревожность (ЭТ): сумма паттернов «движение на месте», «вертикальная стойка», «стойка с упором»; ориентировочно-исследовательская активность (ОИА): сумма активных паттернов «перемещение», «обнюхивание», «норка» [6].

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили непараметрическими методами. При сравнении групп использовали критерий (U) Манна–Уитни, для выявления связи признаков - корреляционный анализ по Спирмену. Различия считали значимыми при р<0,05.

Результаты исследования и обсуждение. Анализ результатов исследования в ОП контрольных животных показал, что в первые минуты тестирования воздействие необычных эмоциогенных факторов вызывало преобладание реакций замирания. Далее был переход в поведение патрулирования с активацией горизонтальной локомоции и исследовательских паттернов. Но, несмотря на общую схожесть поведенческих реакций, были выявлены статистически значимые различия по ряду показателей в контрольных группах животных с разной устойчивостью к гипоксии, что укладывается в логику теории адаптационных стратегий, согласно которой высокоустойчивые крысы склонны к пассивному восприятию действия раздражителя (толерантная стратегия), а низкоустойчивые к активному преодолению действия патогенного фактора (резистентная стратегия) [2].

Контрольные ВУ крысы демонстрировали достоверно меньшие показатели ориентировочно-исследовательской активности (рис. 1А), горизонтальной двигательной активности (ГДА) по числу пересеченных квадратов (рис. 1Б). Для НУ животных контрольной группы были характерны статистически значимо более высокие показатели эмоциональной тревожности (рис. 1В) и анксиогенной дефекации, что свидетельствует о большем уровне их эмоциональной тревожности по сравнению с ВУ.

Остановка системного кровообращения и 5-минутная тотальная ишемия вызвали значительные нарушения процессов высшей нервной деятельности животных, выраженность которых коррелировала с устойчивостью к гипоксии. В первые сутки ориентировочно-исследовательская активность обеих групп крыс характеризовалась значительным угнетением практически всех компонентов. ГДА у НУ крыс снижалась на 60%, ОИА на 38%, у ВУ соответственно на 44% и 29% (р<0,05). В обеих группах в несколько раз снижался интегральный показатель эмоциональной тревожности. Количество актов груминга у низкоустойчивых к гипоксии особей значимо сокращалось, а у высокоустойчивых не имело достоверных различий с контролем, при том что характер его был незавершенным. Анализ паттернов поведения свидетельствовал о трудностях построения адекватной формы реагирования, особенно у НУ животных. Резкое снижение двигательной и ориентировочно-исследовательской активности значительно затрудняет получение полезного результата (избегание опасности), достигаемого в ходе реализации генетически детерминированной резистентной стратегии адаптации.

Начиная с третьих суток отмечалось повышение двигательной и ориентировочно-исследовательской активности в обеих группах (рис. 1АБ): у ВУ крыс в большей степени усиливалась ОИА (до 147% от контрольного уровня, р<0,05), у НУ – значимо увеличивалась ГДА (240%). Горизонтальная двигательная активность ВУ животных своих максимальных значений достигла на 7-е сутки, а ориентировочно-исследовательская на 14-е (244% и 278% от уровня контроля соответственно, р<0,05). К концу эксперимента ГДА возвращалась к исходным значениям, а уровень ОИА оставался повышенным (р<0,05). Резкий статистически значимый рост двигательной активности НУ животных (в 2,4 раза), зафиксированный на третьи сутки, сохранился и в последующие периоды наблюдения: 5-е сутки (в 3,2 раза), 7-е сутки (в 3,7 раза), 14-е сутки (в 3,3 раза), что свидетельствует о готовности к реализации резистентной стратегии адаптации [7]. К концу пятой недели наблюдения показатели двигательной активности вернулись к контрольным цифрам. Уровень ОИА во все контрольные сроки, за исключением 1-х и 35-х суток, был значимо выше исходных показателей с максимумами на 5-7-е (223-230%) и 21-е сутки (176%).

Интегральный показатель эмоциональной тревожности после синхронного значимого снижения в обеих группах в раннем постреанимационном периоде к 5-м суткам начал повышаться (рис. 1В). У ВУ животных рост происходил градуально и на 14-е сутки превысил контрольные значения в 1,2 раза (р<0,05). У НУ особей после 5-х суток наметился новый спад эмоциональной тревожности, который к 14-м суткам упал до очередного минимума (в 2 раза ниже исходных данных, р<0,05). Таким образом, в этой группе показатель ЭТ был значимо ниже контрольных значений весь период наблюдения.

Рис. 1. Объем и структура паттернов поведения крыс с разной устойчивостью к гипоксии по тесту «открытое поле» в динамике восстановительного периода после воздействия экстремальной гипоксии, в % к показателям контрольной группы:

А – ориентировочно-исследовательская активность, Б – горизонтальная двигательная активность, В – эмоциональная тревожность

Примечание: * – статистически значимые отличия с контролем ВУ, # – с контролем НУ, р < 0,05

Обращает на себя внимание тот факт, что параллельно с активацией ориентировочно-исследовательских паттернов у ВУ особенно значительно, по сравнению с НУ, повышался уровень эмоциональной тревожности. Рост тревожности, сопряженный с увеличением содержания циркулирующего кортикостерона, некоторые авторы рассматривают как адаптивную реакцию организма, позволяющую осуществить необходимую мобилизацию ресурсов [7]. Если перенесенную гипоксию рассматривать как стресс, то очевидно, что увеличение выброса глюкокортикоидов будет связано с усилением образования экстрагипоталамического кортиколиберина, являющегося основным медиатором тревожности, и сопровождаться повышением тревожности [8]. Однако в наших исследованиях мы не выявили однозначной корреляционной зависимости между уровнями циркулирующего кортикостерона и тревожности. В частности, к концу первых суток после критического воздействия на фоне максимального роста кортикостерона у ВУ крыс (до 142% от исходных данных, р<0,05) в тесте ОП наблюдались минимальные показатели ЭТ (рис. 1В). В группе НУ животных наивысшие значения кортикостерона определялись на 3-и сутки (168%, р<0,05), а интегральный показатель ЭТ был близок к минимальному (50%, р<0,05). Коэффициенты корреляции в эти периоды не были статистически значимы. В период 14-21-е сутки у ВУ крыс эмоциональная тревожность была наиболее высокой, а уровень кортикостерона низким, тогда как при таком же примерно уровне стресс-гормона у НУ животных ЭТ была ниже исходной. В этих случаях корреляционная связь была статистически значимой.

Поскольку реализация эффектов кортикостерона осуществляется через кортикостероидные рецепторы, логично было бы предположить, что указанные особенности поведенческих реакций связаны не столько с уровнем гормона, сколько с экспрессией центральных кортикостероидных рецепторов. Это тем более интересно, что в последнее время все больше появляется публикаций, связывающих развитие депрессии у больных с нарушением экспрессии ГР [3; 8]. В наших исследованиях у ВУ крыс была выявлена статистически значимая отрицательная корреляционная зависимость между иммунореактивностью ГР гипоталамической области мозга и уровнем эмоциональной тревожности средней силы в 1-5-е сутки (коэффициент корреляции Спирмена ρ = 0,52–0,58), умеренная на 7-е (ρ=0,44), сильная в период 14-21-е сутки (ρ > 0,7).

Рис. 2. Соотношение экспрессии глюкокортикоидных и минералокортикоидных рецепторов в гиппокампе крыс с разной устойчивостью к гипоксии в динамике восстановительного периода, в % по отношению к контролю: А – показатели крыс с высокой устойчивостью,

Б – с низкой устойчивостью к гипоксии

Примечание: * – статистически значимые различия с контролем, р<0,05

У НУ животных подобной четкой зависимости выявлено не было. Такая неоднозначность связана, вероятнее всего, с уровнем экспрессии минералокортикостероидных рецепторов. МР, обладающие высоким сродством к кортикостероидам и не играющие самостоятельной роли в стресс-реактивности, способствуют функциональности ГР, в основном путем максимального связывания глюкокортикоидов [9]. В результате именно МР способны устанавливать порог активации оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники. Экспрессия МР имеет прямые защитные эффекты на нейронном уровне; оверэкспрессия МР снижает гибель нейронов после транзиторной церебральной глобальной ишемии. Считается, что в процессах устойчивости нейронов мозга к критическим воздействиям особенное значение имеет соотношение экспрессии МР и ГР: именно преобладание иммунореактивности МР играет нейропротекторную роль [10].

В наших исследованиях у крыс с низкой устойчивостью к гипоксии иммунореактивность минералокортикоидных рецепторов на всем протяжении эксперимента была снижена, а соотношение экспрессии МР/ГР в основном было в пользу последних (рис. 2Б). У ВУ наблюдалось менее значительное, по сравнению с НУ, нарушение соотношения экспрессии ГР и МР (рис. 2А). Другими словами, МР поддерживает функциональность ГР, и это позволяет более полно проявиться адаптивным эффектам гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы в поведенческой сфере.

Заключение

Выявленные сдвиги паттернов поведения связаны корреляционными взаимосвязями с изменением иммунореактивности глюко- и минералокортикоидных рецепторов и их соотношениями в гипоталамической области мозга. У низкоустойчивых крыс иммунореактивность МР была значимо редуцирована в 1, 3, 7, 14-е сутки, а соотношение экспрессии МР/ГР было преимущественно в пользу глюкокортикоидных рецепторов. У высокоустойчивых животных иммунореактивность МР не опускалась статистически значимо ниже контрольных значений, при этом соотношение двух типов кортикостероидных рецепторов либо не нарушалось (3-и сутки), было несущественным (1, 14, 21, 35-е), либо значительно преобладала активность минералокортикоидных рецепторов (5, 7-е сутки). Таким образом, снижение вследствие гипоксического повреждения иммунореактивности МР прежде всего, и лишь затем избыточная экспрессия ГР являются факторами, влияющими на характер поведенческих реакций в динамике восстановительного периода.