Рак желудка является одной из наиболее актуальных проблем современной онкологии, что связано с высокими показателями заболеваемости как в мире, так и в России, инвалидизацией больных, а также сохраняющейся высокой смертностью и низкой 5-летней выживаемостью, несмотря на внедрение в клиническую практику в последние годы ряда новых методов лечения. Ежегодно в мире регистрируется около 1 млн новых случаев рака желудка, а злокачественные новообразования этой локализации составляют около 6,8 % в структуре онкологической заболеваемости. В России в 2014 году заболеваемость составила 95,2 на 100 000 населения. Более чем в 70 % случаев рак желудка диагностируется на поздних стадиях заболевания. Радикальное лечение проводится только у 42,1 % пациентов с впервые выявленным заболеванием, в большинстве случаев (71 %) – с применением только хирургического метода лечения. Поздняя диагностика и агрессивное течение опухолевого процесса являются важнейшими причинами высокой смертности населения от рака желудка. В 2004–2014 годах в России в течение первого года летальность от злокачественных новообразований этой локализации составила около 50 % [1]. Представленные данные свидетельствуют о необходимости поиска новых подходов к терапии пациентов раком желудка, а также поисков предикторов эффективности применения различных методов лечения.

Одним из таких подходов, активно разрабатываемых в последние годы, является неоадъювантная терапия (НТ) [2]. Показано, что основными причинами неудовлетворительных результатов хирургического лечения пациентов раком желудка являются уже имеющиеся к моменту выполнения оперативного вмешательства, но клинически неопределяемые метастазы; неудаленные во время операции опухолевые комплексы, локализованные в зоне инвазии, лимфатических узлах, клетчатке и т.д.; а также диссеминированные во время операции, в том числе при лимфодиссекции, опухолевые клетки. В связи с этим основными задачами НТ являются регрессия первичной опухоли и регионарных лимфатических узлов; увеличение числа радикальных операций; уничтожение микрометастазов и циркулирующих раковых комплексов; а также снижение биологического потенциала опухолевых клеток, уменьшение их способности к формированию метастазов при интраоперационной диссеминации [3,4]. Для объективного выбора схем терапевтического воздействия необходимо изучать параметры генетических изменений в опухолях [5].

В проведенных к настоящему времени исследованиях показано, что добавление НТ к хирургическому лечению позволяет улучшить отдаленные результаты лечения. Так, в исследовании, проведенном H. Ohnuma и соавт., было показано, что проведение неоадъювантной химиотерапии (НХТ) при раке желудка позволило добиться снижения стадии заболевания у 26 из 75 пациентов и не приводило к увеличению числа послеоперационных осложнений [3]. В работе Z. Shao и соавт. проведение неоадъювантной химиолучевой терапии (НХЛТ) позволило увеличить 2-летнюю выживаемость до 68,5 % по сравнению с 56,3 % при проведении только хирургического лечения [6].

Одной из важных проблем применения НТ при раке желудка является вариабельность ответа опухолевой ткани на применяемые методы лечения, что определяет различия в эффективности комбинированной терапии и прогнозе заболевания. В настоящее время в онкологии используется термин опухолевый ответ, подразумевающий существенные и стойкие изменения характера онкологического процесса под влиянием лечебных факторов. Опухолевый ответ может рассматриваться как предиктор выживаемости и прогноза [7-9]. Актуальной задачей является поиск новых биомаркеров, позволяющих оценивать изменение биологических свойств опухоли, в частности, снижение биологического потенциала опухолевых клеток и способности их к пролиферации. Среди подобных биомаркеров значительный интерес в последние годы вызывают иммуногистохимические и молекулярно-генетические маркеры [10]. До настоящего времени в литературе отсутствуют данные о возможности использования данных маркеров для оценки лечебного патоморфоза (опухолевого ответа) в процессе комбинированного лечения местно-распространенного рака желудка [11,12].

В связи с вышесказанным была сформулирована цель исследования – изучить возможности применения ряда иммуногистохимических и молекулярно-генетических маркеров в качестве предикторов эффективности НТ и факторов прогноза течения заболевания.

Материалы и методы

В исследование был включен 21 пациент с морфологически верифицированным диагнозом рака желудка. Средний возраст пациентов составил 61 год; было 10 мужчин и 11 женщин.

Всем пациентам проводилась НХЛТ с последующей гастрэктомией D2. Лучевая терапия проводилась в СОД 45 Гр на линейном ускорителе электронов по методике дневного дробления дозы: 1 Гр + 1,5 Гр с интервалом 4–5 часов (50 изоГр). Конкурентно проводилась химиотерапия по модифицированной схеме CapOX (капецитабин 1850 мг/м2 за 2 приема, ежедневно; оксалиплатин 85 мг/м2 в/в кап., 1 и 21 дни курса). Оперативное вмешательство с лимфодиссекцией D2 выполняли через 4–6 нед. Всем пациентам проводилась мультиспиральная компьютерная томография (МСКТ) до начала НХЛТ и через 3,5–4 недели после ее завершения.

Подготовка материала для гистологического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического исследований проводилась по стандартным протоколам.

Для оценки лечебного патоморфоза использовали четырехуровневую систему оценки ответа опухоли, предложенную Японским обществом исследований рака желудка (The Japanese Research Society for Gastric Cancer) [13]:

• 1a – отсутствие резидуальных опухолевых элементов;

• 1b – сохранено менее 10 % элементов опухоли;

• 2 – сохранено 10–50 % элементов опухоли;

• 3 – сохранено 50 % и более объема опухолевой ткани.

В качестве иммуногистохимических маркеров исследовалась экспрессия: HER2/neu, Ki-67, p53, CyklinD1, E-кадгерин. Подсчитывали количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения. Динамика изменения степени интенсивности иммунного окрашивания и числа окрашенных ядер была оценена в биопсийном материале (до терапевтического воздействия) и в операционном материале (после проведения химиолучевой терапии и перерыва в лечении). Оценку молекулярно-генетических маркеров AURKA и TP53 проводили с использованием FISH-метода, анализировали по 100 генетически абберантных клеток. Полученные результаты выражали в процентах.

Сравнивались данные первичной и контрольной МСКТ с целью анализа изменений симптомов опухолевого поражения, структуры, размеров, денситометрической плотности опухоли и регионарных лимфоузлов.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ «Statistica 6.1» (StatSoft, Inc. USA). В таблицах и тексте данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Сравнение полученных данных для двух связанных групп проводили с использованием метода Краскела – Уоллиса. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

При анализе результатов НХЛТ с последующей гастрэктомией D2 оценивалась стадия опухолевого ответа. Было выявлено, что у большинства пациентов – 13 (61,9 %) наблюдается стадия опухолевого ответа 1b, что соответствует сохранению менее 10 % элементов опухоли, у 3 (14,3 %) была выявлена стадия 2 и еще у 3 (14,3 %) – стадия 3 опухолевого ответа. У 2(9,5 %) пациентов ответа на лечение выявлено не было.

При изучении динамики экспрессии иммуногистохимических маркеров было выявлено, что проведение НХЛТ приводит к статистически значимому снижению экспрессии Ki-67 (см. рис. 1а,1б, 1в), CyklinD1 (см. рис. 2а, 2б, 2в), а также тенденции к снижению экспрессии маркера p53 (см. рис. 3а, 3б, 3в).

Рис. 1. а – Динамика изменения экспрессии маркера Ki-67 в процессе проведения неоадъювантной химиолучевой терапии (* – статистически значимые различия),

(Б – биопсийный материал, О – операционный материал);

б – Экспрессия маркера Ki-67 в биопсийном материале, х100;

в – Экспрессия маркера Ki-67 в операционном материале, х100

Рис. 2. а – Динамика изменения экспрессии маркера CyclinD1 в процессе проведения неоадъювантной химиолучевой терапии (* – статистически значимые различия),

(Б – биопсийный материал, О – операционный материал);

б – Экспрессия маркера CyclinD1 в биопсийном материале, х100;

в – Экспрессия маркера CyclinD1 в операционном материале, х100

Рис. 3. а – Динамика изменения экспрессии маркера p53 в процессе проведения неоадъювантной химиолучевой терапии (p=0,11),

(Б – биопсийный материал, О – операционный материал);

б – Экспрессия маркера p53 в биопсийном материале, х100;

в – Экспрессия маркера p53 в операционном материале, х100

При анализе результатов изменения экспрессии маркеров Ki-67, p53, CyklinD1 нами было выявлено, что у большинства больных после проведения НХЛТ наблюдается снижение экспрессии данных маркеров опухолевыми клетками. У 19 (90,4 %) пациентов выявлено снижение экспрессии Ki-67, у 12 (57 %) – снижение экспрессии p53 и у 16(76,2 %) – снижение экспрессии CyklinD1. При этом увеличение экспрессии p53 отмечено у 3(14,5 %), а CyklinD1 – у 2(9,5 %) пациентов. Увеличение экспрессии Ki-67 выявлено только у одного пациента (4,8 %). Экспрессия маркера HER2/neu у большинства пациентов12(57,1 %) оставалась без изменений, у 9 (42,9 %) пациентов отмечено снижение экспрессии данного маркера. У 18 (85,7 %) не менялась экспрессия Е-кадгерин (таблица 1).

Таблица 1

Динамика изменения экспрессии иммуногистохимических маркеров у пациентов раком желудка после проведения неоадъювантной химиолучевой терапии

Нами также проводился анализ динамики изменения среднего числа копий генов AURKA и TP53 на аберрантную клетку до и после проведения химиолучевой терапии (таблица 2). Выявлено статистически значимое снижение числа копий гена AURKA.

Таблица 2

Среднее число копий генов AURKA и TP53 на аберрантную клетку до и после проведения химиолучевой терапии

Важно отметить, что у подавляющего большинства пациентов с патоморфозом 1b наблюдалось снижение экспрессии маркеров p53, CyclinD1, Ki-67, а также уменьшение среднего числа копий AURKA и TP53. У пациентов с патоморфозом стадий 2 и 3 не было выявлено статистически значимого изменения экспрессии маркера р53 (р >0,05), в то время как при патоморфозе стадии 1b отмечается статистически значимое снижение экспрессии данного маркера (p=0,023). Таким образом, динамика изменения и снижение экспрессии данных маркеров могут рассматриваться как прогностический предиктор благоприятного лекарственного патоморфоза.

При оценке категорий Т и N по данным МСКТ, проведенной у 16 больных, оказалось, что при первичном исследовании в 2 случаях определена категория Т1-3, в 9 − Т4а, в 5 − Т4b; N0 диагностирована в 8 случаев, N1 − в 6, N2 − в 2. При контрольном обследовании после завершения НХЛТ Т1-3 определялась у 8, Т4а у 6 и Т4b у 2 пациентов; N0 − у 15, а N2 − у 1 больного. Точность метода при определении категории Т составила 81 %, N – 94 %; во всех ошибочных КТ-заключениях отмечалось завышение стадии Т за счет воспалительных и фиброзных изменений после НХЛТ и занижение категории N из-за микрометастазирования. У большинства пациентов (12 из 16, 75 %) отмечено снижение Т и/или N категорий после НТ.

Поиск новых маркеров опухолевого ответа при проведении комбинированной терапии рака желудка является актуальной проблемой. К настоящему времени в мировой литературе обсуждается возможность, информативность и целесообразность применения нескольких вариантов оценки патоморфоза опухоли – инструментальных методов (лучевые методы диагностики, гастроскопия) и гистологического исследования биопсийного материала [14]. Несмотря на то, что клинические и лучевые методы предоставляют ценную информацию и позволяют произвести первичную оценку эффективности терапии, для точного определения степени патоморфоза необходимо морфологическое исследование операционного и/или биопсийного материала. Пока не найдена корреляция гистологических и клинических изменений и они не могут являться точным предиктором эффективности проводимой терапии, поэтому необходимы дальнейшие исследования, направленные на изучение прогностической и предиктивной ценности широкой панели иммуногистохимических, молекулярно-генетических маркеров и лучевых методов диагностики, а также подтверждение полученных результатов в проспективных исследованиях, в т.ч. рандомизированных [15].

Заключение

В настоящем исследовании предпринята попытка оценить изменение экспрессии иммуногистохимических и молекулярно-генетических маркеров в сопоставлении с патоморфологическими изменениями. Показано, что в операционном материале по сравнению с биопсийным выявлено статистически значимое уменьшение количества клеток, которые экспрессируют CyklinD1 и Ki-67, тенденция к снижению экспрессии маркера p53, снижение среднего числа копий гена AURKA на аберрантную клетку до и после проведения НХЛТ, что свидетельствует о снижении злокачественного потенциала опухоли и является ранним показателем эффективности НТ, а также происходит cнижение категорий усТ и ycN по данным МСКТ, что может служить критерием клинической оценки опухолевого ответа.