Известно, что хорионический гонадотропин, являясь ключевым гормоном беременности, способен оказывать действие на иммунную систему на уровне предшественников зрелых Т-лимфоцитов [1], в результате этого происходит активация гуморального и подавление клеточного иммунного ответа. Так, в тимусе небеременных мышей при введении хорионического гонадотропина увеличивается количество Ki-67 позитивных клеток, что доказывает влияние этого гормона на пролиферативные процессы [2]. Вместе с тем торможение пролиферации и снижение числа митозов при ускорении дифференцировки лимфоцитов в тимусе наблюдается при выключении периферического отдела симпатической нервной системы [3]. Существует прямая зависимость морфофункционального состояния тимуса от активности симпатоадреналовой системы [4]. Тимус быстро и разнообразно реагирует на любые воздействия благодаря тому, что на лимфоцитах имеются рецепторы к катехоламинам [5].

Важную роль для различных стадий дифференцировки лимфоцитов играет ядерный белок р-53 – фактор транскрипции, который регулирует клеточный цикл и активирует белки, участвующие в репарации поврежденной ДНК. Если поврежденную ДНК восстановить невозможно, то белок р-53 запускает апоптоз [6], процессы которого, наряду с процессами пролиферации, являются основными механизмами, контролирующими иммунный гомеостаз. В связи с этим участие катехоламинов в процессах с участием белка p-53 при адаптации тимуса мышей к поступлению хорионического гонадотропина представляет определенный научный интерес.

Целью исследования явилось изучение морфологических, иммуногистохимических характеристик и катехоламинсодержащих структур тимуса мышей на фоне введения хорионического гонадотропина.

Материал и методы

Объектом исследования служил тимус 100 белых лабораторных небеременных четырехнедельных мышей-самок, содержавшихся в условиях лабораторного вивария на стандартном рационе со свободным доступом к воде и корму. Животные были разделены на 3 группы: I – интактная группа (n=20); II – контрольная группа: внутримышечно вводили 0,02 мл физраствора (Люблинский фармацевтический завод, Польша) на животное 2 раза в неделю: II А – в течение одной недели (n=10); II Б – в течение двух недель (n=10); II В – в течение трех недель (n=10); II Г – в течение четырех недель (n=10); III – опытная группа: мышам вводили 2 Международных единицы (МЕ)/животное раствора хорионического гонадотропина (ФГУП «Московский эндокринологический завод», Россия), 2 раза в неделю: III А – в течение одной недели (n=10); III Б – в течение двух недель (n=10); III В – в течение трех недель (n=10); III Г – в течение четырех недель (n=10).

Дозировку гормона рассчитывали в зависимости от веса животных так, чтобы она была эквивалентна 500 МЕ – дозировке, применяемой в клинической практике. Все инъекции проводились с соблюдением правил асептики и антисептики. Процедуры по уходу за животными осуществляли согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» («Приказ МЗ РФ от 19.06.2003 г. № 267») и в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях».

Тимус извлекался в одно и то же время суток с 16 до 18 часов, непосредственно после декапитации животных, часть органа замораживали для последующего приготовления криостатных срезов и постановки люминесцентно-гистохимических реакций, часть органа фиксировали в 10 % растворе формалина с последующей заливкой в парафин и проведением иммуногистохимических реакций.

Люминесцентно-гистохимический метод Фалька – Хилларпа в модификации Е.М. Крохиной [7] применялся для выявления в тимусе адренергических нервных волокон и клеток, содержащих катехоламины. Криостатные срезы тимуса инкубировали в камере в парах формальдегида («Лабтех», Россия) в течение 60 минут при температуре 80 °С. Люминесцентный метод основан на реакции моноаминов с формальдегидом, в ходе которой образуются флуоресцирующие соединения. При этом происходит цепь химических реакций, в результате которых с начала катехоламины превращаются в 6,7-диокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин и 4,6,7-триокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин, а затем в процессе дегидрогенизации из них образуются флуоресцирующие соединения – 3,4-дигидро-изохинолины. При просматривании препаратов под люминесцентным микроскопом с использованием запирающегося фильтра низкие концентрации флуоресцирующих соединений визуализируются изумрудно-зеленым цветом, высокие – желтым цветом. Микроскопия препаратов тимуса производилась под люминесцентным микроскопом при длине возбуждающего света 360 нм (люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ-4А (ЛОМО, СССР).

Количественный уровень катехоламинов в тимусе определяли методом цитоспектрофлуориметрии с использованием люминесцентной фотометрической насадки ФМЭЛ-1А (ЛОМО, СССР) и выражали в условных единицах флуоресценции (усл. ед.).

Клетки, экспрессирующие белок p-53, выявляли иммуногистохимическим методом непрямого иммуноферментного анализа [8]. Применяли поликлональные антитела к белку апоптоза р-53 (Santa Cruze, CША). Согласно протоколу производителя окрашивание проводили ручным и аппаратным способами с использованием иммуногистохимических автоконтейнеров AUTOSTAINER-360 (THERMO, Великобритания) и Leica BOND-MAX (Германия). Продукты иммунной реакции визуализировались при помощи стрептавидин-биотинового пероксидазного метода («Dako», LSAB+Kit,HRP), раствор диаминобензидина («Dako», Liguid DAB+) применяли в качестве красящего соединения.

Статистическая обработка полученного цифрового массива проводилась с помощью программы Microsoft Office Excel, оценка статистической значимости различий средних величин проводилась с применением критерия Манна – Уитни. Определяли значимость различий показателей контрольных (введение физраствора) и опытных групп (введение ХГ) между собой и по сравнению с интактной группой: * – различия с контрольной группой, p < 0,05; ** – различия с контрольной группой, p < 0,001; ри – различия с интактной группой, ри < 0,05 и ри < 0,001. Средние значения (M) далее в тексте приведены со стандартной ошибкой среднего значения (m).

Результаты исследования. Люминесцентная микроскопия тимусной дольки мышей позволяет идентифицировать мозговое вещество (МВ), корковое вещество (КВ), границу между корковым и мозговым веществом. В корковом веществе долек тимуса и вокруг мозгового вещества дольки располагаются люминесцирующие гранулосодержащие клетки (ЛГК), при иммерсионном увеличении (х900) в них видны отдельные гранулы беловато-желтого цвета (рис. 1).

Рис. 1. Введение ХГ в течение четырех недель.

Катехоламинсодержащие клетки коркового вещества долек тимуса мыши.

Метод Фалька – Хилларпа. Микроскоп ЛЮМАМ-4А. Об.40. Ок.10

Люминесцентная микроскопия выявляет в тимусе и тучные клетки [2]. Также определяются адренергические нервные волокна, проникающие в дольки тимуса в виде периваскулярных сплетений. Нервные окончания располагаются в корковом веществе долек тимуса в непосредственной близости с ЛГК между корковым и мозговым веществом и ЛГК коркового вещества, они имеют изумрудно-зеленый цвет.

Поступление в организм физиологического раствора на разных сроках эксперимента визуально не изменяет ни люминесцентно-морфологическую картину долек тимуса мышей, ни яркость свечения гранул в содержащих их клетках. В свою очередь, введение хорионического гонадотропина сопровождается появлением на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса второго ряда люминесцирующих клеток – «удвоением» кортико-медуллярной границы, при этом визуально увеличивались размеры мозгового вещества, а гранулосодержащие клетки казались менее яркими.

Проведенная цитоспектрофлуориметрия показала, что введение гормона существенно изменяет интенсивность люминесценции катехоламинов в изучаемых структурах тимуса, при этом для интактной группы и всех контрольных групп показатели были вполне сопоставимы (Таблица 1a, 1b). Данные таблицы показывают, что в подавляющем большинстве структур, содержащих катехоламины, на всех сроках введения гормона наблюдается снижение интенсивности их люминесценции.

Таблица 1а

Интенсивность люминесценции катехоламинов в структурах тимуса мышей

(усл. ед. х102, M±m) при введении хорионического гонадотропина (ХГ)

Примечание:

* p < 0,05; ** p < 0,001 – уровень достоверности различий по отношению к контрольной группе мышей;

ри < 0,05; ри < 0,001 – уровень достоверности различий по отношению к интактной группе мышей.

Таблица 1b

Интенсивность люминесценции катехоламинов в структурах тимуса мышей (усл. ед. х102, M±m) при введении хорионического гонадотропина (ХГ)

Примечание:

* p < 0,05; ** p < 0,001 – уровень достоверности различий по отношению к контрольной группе мышей;

ри < 0,05; ри < 0,001 – уровень достоверности различий по отношению к интактной группе мышей.

Иммуногистохимическая реакция с использованием антител к маркеру апоптоза белку р-53 позволила нам выявить клетки с коричневой окраской цитоплазмы и цитоплазматической мембраны разной степени интенсивности в корковом и мозговом веществах долек тимуса и произвести их подсчет (рис. 2, таблица 2).

Рис. 2. Позитивная реакция на белок p-53 в клетках мозгового (слева) и коркового (справа) вещества долек тимуса мыши. Клетки, содержащие белок p-53, имеют коричневую окраску. Микроскоп Leica DM4000B. Об.40. Ок.10

Таблица 2

Количество клеток, содержащих белок р-53, в поле зрения в морфофункциональных зонах долек тимуса экспериментальных мышей, шт.

* – различия с интактной группой статистически значимы, p < 0,05;

** – различия с интактной группой статистически значимы, p < 0,001.

Данные таблицы свидетельствуют о том, что имеет место прямая зависимость между длительностью введения хорионического гонадотропина и увеличением количества клеток, содержащих белок р-53 в корковом веществе долек тимуса мышей. Кроме того, обращает на себя внимание появление клеток, содержащих белок р-53, в мозговом веществе долек тимуса мышей, получавших гормон.

Обсуждение полученных данных. Поступление хорионического гонадотропина приводит к увеличению экспрессии белка р-53 в клетках коркового вещества долек тимуса прямо пропорционально длительности воздействия. На протяжении всего срока эксперимента интенсивность люминесценции катехоламинов в структурах тимусной дольки мышей опытных групп снижена по сравнению с интактными животными, что может свидетельствовать о возможном участии нейромедиаторных биогенных аминов, в частности катехоламинов, в процессах апоптоза в клетках тимуса мышей при действии хорионического гонадотропина. Результаты нашего исследования хорошо согласуются с имеющимися литературными данными. Так, обнаружена прямая связь между катехоламинергической иннервацией и экспрессией белков апоптоза: просходит усиление синтеза белка р-53 при обеднении иннервации в нейронах гипоталамуса [9]. Роль рецепторов к адреналину в развитии CD4+ лимфоцитов подчеркивается в работе W. N. Kin, V. M. Sanders [5]. Моделирование иммунного ответа in vitro показывает, что при добавлении в среды культивирования норадреналина наблюдается максимальное приближение результатов опытов к процессам, происходящим в живом организме. Роль катехоламинов в микроокружении лимфоцитов в становлении и развитии иммунного ответа рассмотрена и М. А. Самотруевой и соавторов [10]. В то же время литературный обзор, посвященный медиаторам стресса матери и плода во время беременности, свидетельствует, что стресс обеспечивается многими синергетическими механизмами передачи, к которым, наряду с кортизолом, можно отнести катехоламины, серотонин, цитокины и материнскую микрофлору [11]. Заслуживает внимания публикация, в которой роль катехоламинов в процессе влияния материнского стресса на развитие плода выделяется в качестве самостоятельной научной проблемы [12]. Проведенные нами исследования дают основание предположить, что, хорионический гонадотропин, изменяя выделение катехоламинов из периферических нервных волокон и тучных клеток, наряду с иммуномодулирующей функцией, наблюдаемой нами в тимусе лабораторных мышей, осуществляет еще и другую функцию – снижает для плода риск от возможных негативных последствий стресса, которым является для материнского организма беременность.

Заключение

Введение хорионического гонадотропина на всех сроках воздействия приводит к уменьшению интенсивности люминесценции в подавляющем большинстве катехоламинсодержащих структур тимуса лабораторных мышей. При этом в корковом веществе долек тимуса имеет место прямая зависимость между длительностью введения хорионического гонадотропина и увеличением количества клеток, содержащих белок р-53.