По литературным данным, бактерии рода Proteus - это кишечные грамотрицательные подвижные палочки, которые часто показывают плеоморфизм на плотной питательной среде, отсюда и соответствующее название рода [1; 2]. Часто выделяются из мясных, рыбных и овощных продуктов, особенно тех, которые подвергаются порче при температуре диапазона мезофилов. Бактерии рода Proteus регистрируются в шести экологических источниках происхождения организмов, обнаруживаемых в пищевых продуктах: почве и воде, растительных продуктах, пищевом инвентаре, желудочно-кишечном тракте, при транспортировке/хранении продуктов, шкурах животных [1; 3-8].
В настоящее время выделение и идентификация бактерий рода Proteus регламентируется межгосударственными стандартами. Методы выявления основаны на посеве исходного разведения анализируемой пробы продукта или другого эквивалентного разведения в питательные среды, культивировании посевов при (37 ± 1) °С в течение 24-48 ч, выделении типичных и (или) предполагаемых колоний, подтверждении их принадлежности по культуральным, морфологическим признакам и биохимическим свойствам к бактериям рода Proteus [9; 10].
По литературным данным, в настоящее время повышается значимость бактериофагов как высокоспецифического метода индикации и идентификации [11]. Поэтому исследовательская работа в области поиска эффективных методов выделения и идентификации бактериальных агентов, контаминирующих пищевые продукты и вызывающих тем самым их порчу, направлена на конструирование специфических фаговых биопрепаратов [12].
Применение бактериофагов как универсального механизма, способного элиминировать (разрушать) специфичные бактерии, позволяет использовать этот биологический феномен в качестве безопасного средства деконтаминации пищевого сырья. Конструирование биопрепаратов на основе бактериофагов требует изучения их основных биологических свойств с целью получения высокоэффективного средства с широким спектром действия.
Цель и задачи исследований
Цель работы – изучение некоторых биологических свойств бактериофагов рода Proteus с целью конструирования фагового биопрепарата для обработки пищевого сырья и готовой продукции, способствующего увеличению сроков хранения, позволяющего элиминировать вышеназванные микроорганизмы с поверхности рыбной и мясной продукции.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- определить литическую активность бактериофагов Proteus (методами Аппельмана и Грациа);
- изучить морфологию негативных колоний бактериофагов Proteus,
- определить специфичность действия бактериофагов Proteus;
- изучить спектр литического действия выделенных и селекционированных бактериофагов Proteus;
- зафиксировать изменения литической активности протейных бактериофагов при хранении;
- изучить урожайность протейных бактериофагов.
Объекты и методы исследований
Бактериофаги, специфичные к культурам рода Proteus, 6 изолятов: FPr-10 УГСХА, FPr-11 УГСХА, FPr-12 УГСХА, FPr-13 УГСХА, FPr-14 УГСХА, FPr-15 УГСХА, выделенные и селекционированные авторами самостоятельно в 2015-2016 гг. В работе было использовано 58 штаммов бактерий рода Proteus (Proteus vulgaris и Proteus mirabilis); 69 штаммов бактерий: Escherichia spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., Morganella spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., Yersinia spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp., Providenvia spp., полученных из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО «Ульяновский ГАУ» и выделенных авторами самостоятельно из проб мясного и рыбного сырья и готовых продуктов. Все культуры обладали типовыми свойствами и хранились при температуре 2-4 °С в столбике 0,7% мясо-пептонного агара. В исследованиях использовали 20±2 часовые культуры микроорганизмов (температура культивирования 36±1 °С).
В исследованиях применяли питательный бульон ТУ 10-02-02-789-176-94 (ООО «БиоКомпас-С», РФ), питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар) ТУ 9398-020-78095326-2006 (ФБУН ГНЦ ПМБ, РФ), генцианвиолет 548-62-9 (ЗАО «Вектон», РФ).
Изучение биологических свойств бактериофагов проводили при температуре культивирования 36±1 °С, время термостатирования посевов 18±2 часа по отработанным ранее методикам [3]. Литическую активность фагов (концентрацию фаговых частиц) определяли методом агаровых слоев по A. Gratia в двухслойном мясо-пептонном агаре и методом разведений (титрования) по Аппельману. Посев последовательных разведений фагового препарата с целью повышения точности эксперимента проводили трижды. Морфология негативных колоний (бляшкообразующих единиц) протейных фагов изучалась при визуальном осмотре результатов посева чашечным методом по методике A. Gratia [13].
Адсорбцию протейных бактериофагов изучали при взаимодействии их с индикаторными культурами по М. Адамсу (1961) в модификации Золотухина С.Н. (2007), которая основана на исследовании количества корпускул неадсорбированного фага в смеси бактерия-фаг [12]. Адсорбцию фага FPr - 11 УГСХА изучали на клетках Proteus vulgaris 42; FPr - 13 УГСХА - Proteus vulgaris 53. Время адсорбции для фагов устанавливали индивидуально в зависимости от процента максимальной адсорбции для конкретной смеси (фаг+клетка хозяина).
Для определения длительности латентного периода и урожайности фага использовали способ изучения одиночного цикла размножения фага без применения антифаговой сыворотки. В основу метода определения длительности латентного периода и урожайности фага положено свойство эмбихина избирательно инактивировать различные фаги без повреждения бактерий [14].
Результаты исследований
Исследования по определению литической активности - титра бактериофагов рода Proteus позволяют нам утверждать, что они имеют различный титр в диапазоне от 10-6 до 10-8 по Аппельману и от 2,4±0,1х107 до 5,7±0,1х109 БОЕ (бляшкообразующих единиц)/мл по Грациа.
Морфология негативных колоний – это основной биологический признак клонов бактериофагов, позволяющий проводить скрининговые дифференциальные тесты бактериальных патогенов на газоне индикаторной культуры. Определено, что при высеве на МПА образуются бляшкообразующие единицы с четким краем и прозрачным центром различного диаметра в диапазоне от 0,5±0,1 до 0,9±0,1 мм (табл. 1).
Для определения специфичности изучаемых протейных бактериофагов были проведены эксперименты на культурах Providenvia spp., Morganella spp., Escherichia spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., Yersinia spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp. Экспериментально было установлено отсутствие зон лизиса на газоне вышеназванных культур, что свидетельствует о строгой специфичности изучаемых протейных фагов.
Таблица 1
Показатели некоторых биологических свойств изучаемых протейных бактериофагов
|
№ |
Название протейного бактериофага и индикаторной культуры, на которой он селекционируется |
Результат изучения характерных биологических свойств бактериофагов рода Proteus на индикаторной бактериальной культуре |
|||
|
Литическая активность, БОЕ /мл (по методу агаровых слоев по Грациа) |
Литическая активность (по методу Аппельмана) |
Спектр литического действия на культуре (по Отто) |
Диаметр негативных колоний, мм |
||
|
1 |
FPr - 10 УГСХА / Proteus vulgaris 41 |
2,4±0,1х108 |
10-7 |
++ |
0,5±0,1 |
|
2 |
FPr - 11 УГСХА / Proteus vulgaris 42 |
3,1±0,1х109 |
10-8 |
+++ |
0,6±0,1 |
|
3 |
FPr - 12 УГСХА / Proteus vulgaris 43 |
1,4±0,3х108 |
10-7 |
+ |
0,9±0,1 |
|
4 |
FPr - 13 УГСХА / Proteus vulgaris 53 |
5,7±0,1х109 |
10-8 |
+++ |
0,5±0,1 |
|
5 |
FPr - 14 УГСХА / Proteus vulgaris 54 |
2,4±0,1х107 |
10-6 |
+ |
0,7±0,1 |
|
6 |
FPr - 15 УГСХА / Proteus vulgaris 56 |
2,6±0,1х108 |
10-7 |
++ |
0,8±0,1 |
Примечание: «+» - наличие зоны лизиса по ходу стекания капли бактериофага на газоне культуры, принадлежащей к роду Proteus;
«++» - наличие зоны лизиса и отдельных стерильных пятен по ходу стекания капли бактериофага на газоне культуры, принадлежащей к роду Proteus;
«+++» - наличие стерильного пятна и зон лизиса по ходу стекания капли бактериофага на газоне культуры, принадлежащей к роду Proteus.
Полученные данные по изучению спектра литического действия свидетельствуют о том, что изучаемые бактериофаги рода Proteus активно работают в широком диапазоне изучаемых культур. Совокупный процент лизиса 58 протейных штаммов у 6 бактериофагов составляет 100%. Выявлены два бактериофага FPr - 11 УГСХА и FPr - 13 УГСХА, совокупный лизис которых также составляет 100%.
Исследования протейных бактериофагов, закрытых в стерильные флаконы без добавления консерванта, которые хранились в условиях бытового холодильника (2-4 °С), проводили методом диффузии в «мягкий» методом агаровых слоев по A. Gratia. Результаты исследований представлены в таблице 2. Установлено, что в течение 1-3 месяцев показатели литической активности исследуемых бактериофагов остались без изменений. Последующие исследования свидетельствуют об относительно невысокой скорости снижения показателя литической активности в пределах 6 месяцев, когда велся мониторинг данного показателя. Последующее 5-6-кратное пассирование бактериофагов на индикаторных культурах позволило восстановить исходный титр фага, который был установлен при укупоривании в стерильные флаконы.
Таблица 2
Изменение литической активности протейных бактериофагов при хранении
|
|
Название протейного бактериофага и индикаторной культуры, на которой он селекционируется |
Литическая активность, БОЕ /мл (по методу агаровых слоев по Грациа) |
|||
|
перед закупориванием |
через 1 месяц |
через 3 месяца |
через 6 месяцев |
||
|
1 |
FPr - 10 УГСХА / Proteus vulgaris 41 |
2,4±0,1х108 |
2,3±0,1х108 |
2,1±0,1х108 |
1,6±0,1х107 |
|
2 |
FPr - 11 УГСХА / Proteus vulgaris 42 |
3,1±0,1х109 |
3,0±0,1х109 |
2,9±0,1х109 |
2,0±0,1х108 |
|
3 |
FPr - 12 УГСХА / Proteus vulgaris 43 |
1,4±0,3х108 |
1,3±0,1х108 |
1,2±0,3х108 |
0,9±0,1х107 |
|
4 |
FPr - 13 УГСХА / Proteus vulgaris 53 |
5,7±0,1х109 |
5,6±0,1х109 |
5,3±0,1х109 |
4,9±0,1х108 |
|
5 |
FPr - 14 УГСХА / Proteus vulgaris 54 |
2,4±0,1х107 |
2,3±0,1х107 |
2,1±0,1х107 |
1,8±0,1х106 |
|
6 |
FPr - 15 УГСХА / Proteus vulgaris 56 |
2,6±0,1х108 |
2,4±0,1х108 |
2,2±0,1х108 |
1,9±0,1х107 |
В результате проведенных экспериментов было установлено, что два протейных бактериофага FPr - 11 УГСХА и FPr - 13 УГСХА характеризуются максимально высокими титрами и незначительно снижают их в течение 6 месяцев. Вышеназванные бактериофаги будут в перспективе использованы для конструирования экспериментального биопрепарата. Изучение показателей урожайности протейных бактериофагов определялось у фагов FPr - 11 УГСХА и FPr - 13 УГСХА.
При определении адсорбционных способностей протейных бактериофагов было установлено, что изучаемые фаги имели разные показатели скорости адсорбции: фаг FPr - 11 УГСХА за 6 минут адсорбировался на клетках Proteus vulgaris 42 в количестве 68,8%, константа скорости адсорбции К= 3,8 см 3/мин-1; фаг FPr - 13 УГСХА при контакте с клетками Proteus vulgaris 53 в течение 7 минут адсорбировался на них 87,2%, константа скорости адсорбции составила К= 5,8 см 3/мин-1. Установлено, что наиболее выраженные показатели скорости адсорбции на клетках-хозяев были у бактериофага FPr - 11 УГСХА.
Для определения длительности латентного периода и урожайности фага в предварительном опыте параллельного титрования эмбихина на исследуемых фагах FPr - 11 УГСХА и FPr - 13 УГСХА и штаммах Proteus vulgaris 53 и Proteus vulgaris 42 первоначально устанавливали рабочую дозу препарата, т.е. то его количество, которое в 0,9 мл физиологического раствора способно было за 5 минут при 36±1 °С инактивировать 90-95% фага при исходной его концентрации 3-5х107 БОЕ/мл. Опытным путем определено, что препарат в рабочей дозе в аналогичных условиях не должен оказывать антибактериального действия при контакте с 4,4х108 м.к./мл. В экспериментах определено, что рабочая доза эмбихина была равна 7 γ, т.е. среднему из двух последних эффективных доз. После определения рабочей дозы проводили основной опыт. Бактериальные культуры, выращенные в мясо-пептонном бульоне и находящиеся в логарифмической фазе роста, разводили мясо-пептонным бульоном до концентрации бактерий 4,4х108 м.к./мл. К 0,9 мл такой культуры, предварительно адаптированной к 36±1 °С, добавляли соответствующего бактериофага 0,1 мл, содержащего 4,4х108 БОЕ/мл, смесь инкубировали в термостате в течение 5 минут, а затем 0,1 мл переносили в 0,9 мл физиологического раствора с рабочей дозой эмбихина, предварительно прогретого в водяной бане при 36±1 °С. После 5-минутной инкубации смеси при 36±1 °С опыт продолжали по методу Эллиса и Дельбрюка. Затем из этой пробирки брали 0,1 см3 жидкости, которую вносили к 9,9 см3 бульона. Из четвертой пробирки брали 0,1 см3 жидкости и вносили в 9,9 см3 бульона (пятая пробирка). Получая указанные разведения, мы стремились создать постоянную и наименьшую концентрацию частиц фага в четвертой пробирке и максимально уменьшить ее в пятой с целью возможности подсчета колоний фага по окончании латентного периода. Из 4 и 5 пробирок приготовленными разведениями через каждые 1-2 минуты брали по 0,1 см3 жидкости и засевали в две бактериологические чашки по методу агаровых слоев. Подсчет негативных колоний проводили после 16-18-часового инкубирования чашки при 36±1 °С.
Установлено, что латентный период внутриклеточного развития фага FPr - 11 УГСХА на клетках Proteus vulgaris 42 равен 25-26 минутам. Среднее количество бляшкоообразующих единиц на чашках при высеве из 4-й пробирки с 15 по 20 минуту опыта равно 131,1, а при высеве с 40 по 60 минуту из пятой пробирки – 64,45. Средняя урожайность бактериофага FPr - 11 УГСХА равна 6445:133=49,66 вирусной частицы на одну микробную клетку Proteus vulgaris 42. Латентный период внутриклеточного развития фага FPr - 13 УГСХА на клетках Proteus vulgaris 53 равен 21-22 минутам. Среднее количество бляшкообразующих единиц на чашках при высеве из 4-й пробирки с 15 по 20 минуту опыта равно 14, а при высеве с 23 по 60 минуту из пятой пробирки – 19,86. Средняя урожайность бактериофага FPr - 13 УГСХА равна 1986:14=141,9 вирусной частицы на одну микробную клетку Proteus vulgaris 53.
Заключение
При проведении исследований нами были изучены некоторые биологические свойства протейных бактериофагов FPr-10 УГСХА, FPr-11 УГСХА, FPr-12 УГСХА, FPr-13 УГСХА, FPr-14 УГСХА, FPr-15 УГСХА, выделенных и селекционированных авторами самостоятельно в 2015-2016 гг.
Литическая активность бактериофагов рода Proteus составляет 10-6 -10-8 по Аппельману и от 2,4±0,1х107 до 5,7±0,1х109 БОЕ (бляшкообразующих единиц)/мл по Грациа. Наиболее высокие титры имели фаги FPr - 11 УГСХА (3,1±0,1х109 БОЕ/мл; 10-8) и FPr - 13 УГСХА (5,7±0,1х109 БОЕ/мл; 10-8).
Морфология негативных колоний изучаемых фагов представлена бляшкообразующими единицами с четким краем и прозрачным центром различного диаметра в диапазоне от 0,5±0,1 до 0,9±0,1 мм.
Определено, что изучаемые бактериофаги Proteus специфичны в пределах рода, обладают перекрестным лизисом в пределах видов Proteus vulgaris и Proteus mirabilis. Совокупный процент лизиса шести бактериофагов на 58 культурах составил 100%.
Протейные фаги являются строго специфичными в пределах рода и не лизируют культуры: Providenvia spp., Morganella spp., Escherichia spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., Yersinia spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp.
Установлено, что в течение 1-3 месяцев показатели литической активности исследуемых бактериофагов оставались без изменений. Через 6 месяцев наблюдений они снизились на 1 порядок, но были восстановлены 5-6-кратным пассированием на индикаторных культурах.
Определено, что средняя урожайность бактериофага FPr - 13 УГСХА равна 1986:14=141,9 вирусной частицы на одну микробную клетку Proteus vulgaris 53 и средняя урожайность бактериофага FPr - 11 УГСХА равна 6445:133=49,66 вирусной частицы на одну микробную клетку Proteus vulgaris 42.
Изученные свойства протейных фагов позволяют систематизировать биологические особенности каждого из выделенных клонов вирулентных бактериофагов и произвести отбор двух фагов - FPr - 11 УГСХА и FPr - 13 УГСХА для конструирования в перспективе биопрепарата для обработки бактериофагами пищевого сырья и готовой продукции. Результаты экспериментов А.В. Алешкина с соавт. доказывают, что применение бактериофагов способствует увеличению сроков хранения пищевого сырья и продовольственных товаров, так как эффективно элиминируют микроорганизмы с поверхности продукции [15].
Исследования проводятся в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ, выполняемых по заданию МСХ РФ в 2017 году.