В настоящее время особую остроту приобретают проблемы изучения положительного и отрицательного влияния наноматериалов на биологические объекты. Подобные исследования становятся чрезвычайно актуальными, так как расширяется спектр и количество наночастиц, попадающих в окружающую среду, требуется разработка методов оценки последствий воздействия наночастиц на живые организмы, а развитие нанотехнологий становится неотъемлемой частью реализации плана научно-инновационного развития России [1-3].
Биобезопасность нанотехнологий, изучение особенностей поведения наночастиц в окружающей среде, живых организмах, в том числе растениях, является предметом многочисленных исследований [4-6]. Наноматериалы широко используются в оптике, химических технологиях, в медицине, в парфюмерно-косметической промышленности, сельском хозяйстве [7; 8] и т.д.
В первых экспериментальных исследованиях по биотестированию наночастиц предпочтение было отдано растениям. Растения являются разнообразными и доступными объектами, обладают чувствительностью к внешним слабоинтенсивным факторам, иногда на порядок превышающей чувствительность объектов животного происхождения [9]. Известно, что наночастицы размером менее 10 нм способны не только проникать внутрь растительной клетки, но и встраиваться в мембрану. Растения, культивируемые в условиях in vitro, являются хорошим модельным тест-объектом для оценки воздействия наночастиц, которые могут вноситься в питательную среду. Перспективным является изучение особенностей морфогенеза, цитогенетических показателей, взаимодействия наночастиц с внутриклеточными структурами [10].
Наночастицы TiO2 широко используются в современной промышленности как в чистом виде, так и в составе наноматериалов. Только в США четыре крупные компании (Altairnano, Dupont, Nanophase, Nanogram) вырабатывают в год более 100 000 тонн НЧ TiO2, а к 2025 году их производство прогнозируется довести до 2,5 млн тонн. НЧ TiO2 обладают более высоким фотокаталитическим эффектом, чем микрочастицы TiO2 [11; 12], формируя под воздействием УФ-излучения активные формы кислорода, гидроксильные радикалы, H2O2 и др. [13; 14].
Несмотря на широкий спектр исследований по изучению токсических свойств НЧ TiO2, тему нельзя считать достаточно изученной. Исследование токсичности НЧ TiO2 in vitro на разных культурах показало наличие у них выраженных цитотоксических свойств [15; 16]. Фитотоксический эффект НЧ TiO2 был показан на однодольных и двудольных растениях [17] при изучении скорости прорастания семян и удлинения корней, а генотоксический эффект - при анализе показателей митотического индекса, уровня аберраций хромосом и количества микроядер в клетках растений. Основным механизмом токсического действия наночастиц оксида титана является индукция активных форм кислорода, причем реактивность зависит не только от размеров наночастиц, но и от того, какой структурой представлен TiO2 [18].
Целью данного исследования было изучение действия НЧ TiO2 на рост и развитие семян и стерильных эксплантов томата (Lycopersicon esculentum).
Задачи исследования включали:
- оценку энергии прорастания семян, обработанных раствором НЧ TiO2;
- получение стерильных эксплантов томата и введение их в культуру in vitro;
- изучение морфологических характеристик эксплантов томата при культивировании на среде с добавлением НЧ TiO2.
Объекты и методы исследования
Объектами для проведения исследований послужили семена томата (Lycopersicum esculentum) сорта Зарница. Выбор сорта обусловлен его широким применением на юге России, в том числе и в Ростовской области [1].
Стерилизация семян
В качестве эксплантов использовались побеги на стадии первого настоящего листа, полученные из сеянцев. С целью деконтаминации растений вначале проводилась поверхностная стерилизация семян. Для этого семена промывались 20 минут в водопроводной воде с добавлением TWIN-80, затем в ламинар-боксе обрабатывались 1 минуту в 70%-ном этиловом спирте, 5 минут в 20%-ном тимеразоле и 3 раза по 20 минут в стерильной дистиллированной воде. После просушки семена помещались на питательную среду Мурасиге-Скуга с половинным составом без добавления гормонов. На второй неделе культивирования, когда сеянцы достигали стадии первого настоящего листа, вычленялись верхушки сеянца размером около 1 см и переносились на питательную среду с добавлением наночастиц в различной концентрации: 10, 40, 60, 100, 150 мг/л.
Семена проращивались при температуре 25?, фотопериоде 16/8 ч, при освещенности 2500 Кл (для оценки энергии прорастания семян производилась их обработка НЧ TiO2 различной концентрации, для получения стерильных эксплантов использовали стерилизованные, не обработанные НЧ TiO2 семена). В этих же условиях развивались экспланты in vitro. Для каждого варианта эксперимента с определенной концентрацией наночастиц брали по 70 семян.
При культивировании растений томата во всех вариантах оценивали морфологические характеристики эксплантов: длину стебля, количество настоящих листьев, длину корешка.
Для внесения в питательную среду использовали НЧ TiO2, < 100 нм, рутильная форма.
Результаты и их обсуждение
Прорастание семян началось на 7-й день (рис. 1).
Рис. 1. Семена томата на 7-й день после пассажа
Оценка энергии прорастания семян на 14-й день наблюдения показала, что воздействие НЧ TiO2 концентрацией 40 мг/л не оказало воздействия на значение этого показателя и осталось на уровне контрольных значений (75%). С увеличением концентрации НЧ TiO2 происходило снижение значения энергии прорастания. Наименьшее значение энергии прорастания характерно для семян, проросших на питательной среде с добавлением диоксида титана концентрацией 150 мг/л. Результаты представлены в таблице.
Энергия прорастания семян томата на 14-й день, %
|
Концентрация, TiO2 |
Энергия прорастания семян, % |
|
40 мг/л |
84,75 ±1,79 |
|
60 мг/л |
67±2,35* |
|
100 мг/л |
63,5±2,40** |
|
150 мг/л |
62±2,42** |
|
Контроль |
83,5±1,85 |
* - тенденция к достоверности;
* *- достоверность по Τ-критерию Стьюдента при уровне значимости р<0,05.
Было проанализировано изменение длины стебля растений на 14, 21 и 28-й дни наблюдений. Результаты наблюдений представлены на рисунке 2. Наиболее интенсивное развитие проходило в культуре на питательной среде с низким содержанием наночастиц (10, 40 мг/л). Наблюдалась некоторая стимуляция роста стебля на 14-й и 21-й день на среде с добавлением НЧ TiO2 концентрации 40 мг/л. Наиболее существенное угнетение роста стебля наблюдали на 21-й и 28-й день на среде с добавлением НЧ TiO2 концентрацией 100 и 150 мг/л.
Рис. 2. Среднее значение длины стебля после пассажа и культивирования на 14, 21 и 28-й день, мм
Далее определяли визуально количество настоящих листочков во всех вариантах (рис. 3-5). Как видно из представленных данных, ни в одном из вариантов с добавлением наночастиц TiO2 не наблюдалось превышение контрольных значений, а рост на среде с добавлением наночастиц оксида титана концентрациями 100 и 150 мг/л вызывал существенное угнетение процесса роста листьев.
Рис. 3. Растения томата на 14-й день после посева на среду, концентрация наночастиц TiO2 100 мг/л
Рис. 4. Томаты после посева на среду на 21-й день, концентрация наночастиц TiO2 100 мг/л
Рис. 5. Среднее количество настоящих листьев на
14, 21 и 28-й день культивирования томата на питательной среде, ед.
На 28-й день исследования определяли длину корешка у растений томата во всех вариантах. Средние значения длины корня представлены на рисунке 6.
Рис. 6. Среднее значение длины корешка томатов на 28-й день культивирования, мм
Растения на среде с добавлением самых высоких концентраций наночастиц диоксида титана (100 и 150 мг/л) показали наименьшие значения длины корня. В остальных случаях существенных изменений по сравнению с контролем не наблюдалось.
Заключение
Исследования особенностей роста и развития семян и проростков томата на среде с добавлением наночастиц TiO2 разных концентраций показали, что высокие концентрации наночастиц оксида титана (100 и 150 мг/л) оказывают угнетающее воздействие на энергию прорастания семян, морфологические параметры растений (длина корня, длина стебля, количество настоящих листьев). Некоторое стимулирующее воздействие на рост стебля наночастицы диоксида титана в концентрации 40 мг/л оказывали на 14-й и 21-й дни.
Исследование выполнено в лаборатории экологии физиологии растений Ботанического сада ЮФУ в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности Министерства образования и науки РФ № 6.6222.2017/БЧ и Гранта Президента РФ по государственной поддержке ведущих научных школ «Экологические и сельскохозяйственные функции почв в условиях антропогенной нагрузки» № НШ-9072.2016.11. (2016-2017 гг.) с использованием оборудования ЦКП «Биотехнология, биомедицина и экологический мониторинг».