Несмотря на несомненные успехи в лечении и контроле ряда кислотозависимых заболеваний, проблема гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) сохраняет актуальность ввиду высокой распространённости, рефрактерности течения на фоне стандартной терапии и высоких рисков осложненного течения с развитием факультативного предракового состояния - пищевода Барретта (ПБ) [1; 2]. Среди известных пусковых факторов заболевания [3] особый интерес представляют изменения функционального состояния слизистой оболочки (СО) пищевода под воздействием рефлюктата разного характера [4]. Кроме этого, установлено, что проницаемость эпителиального барьера регулируется с помощью молекул межклеточной адгезии и межклеточных контактов [5], которые могут выступать биомаркерами ГЭРБ даже при эндоскопически неизмененной СО пищевода [6]. Однако при его нарушении и повреждении субэпителиального пространства развивается каскад реактивных воспалительных, пролиферативных, регенераторных, а часто и дисрегенераторных процессов, что определяет развитие и тяжесть ГЭРБ [5]. При оценке влияния рефлюктата различной кислотности на морфологическую картину СО пищевода, по данным эндоскопического исследования и 24 часовой pH-импедансометрии, была выявлена прямая зависимость между продолжительностью ацидификации пищевода и выраженностью воспалительных изменений [7]. Так, у пациентов с преимущественно кислым характером рефлюктата частота эрозивно-язвенных изменений СО выше, чем у пациентов со смешанным и щелочным рефлюктатом, у которых имеются высокие риски метаплазии эпителия [8], что объясняется его воздействием на процессы апоптоза и клеточной дифференцировки [9]. Таким образом, под воздействием агрессивного характера рефлюктата происходит ослабевание межклеточных соединений с дальнейшим повреждением эпителия и подлежащих тканей, при этом кислотный «ожог» вызывает гибель клеток и лейкоцитарную инфильтрацию, а некроз, в свою очередь, запускает процессы регенерации, пролиферации базальных клеток и папиллярную гиперплазию базальных кератиноцитов [9].

Анализ литературы позволяет сделать выводы о том, что изменение соотношения и морфологии белков межклеточных контактов коррелирует с увеличением тяжести ГЭРБ [10]. На сегодняшний день наиболее изученными из них являются окклюдины 1, 2, 3, 4, E-кадгерин, семейство клаудинов (1,2), ß-катепсин, реже - EpСАМ, CD44, v4, v5, v6, но полученные данные остаются противоречивыми и требуют уточнения. Так, Pardon N. еt al. (2014), оценивая влияние кислого рефлюктата на функциональную целостность эпителиального барьера и экспрессию белков семейства клаудинов (1, 2, 4), оксида азота-1, филлаггина и оклюдина, не зарегистрировали статистически значимых изменений изучаемых показателей, что, возможно, обусловлено преимущественной локализацией данных белков в зоне кардиоэзофагеального перехода и их «перераспределением» в ответ на воздействие компонентов гастроэзофагеального рефлюктата [11]. К аналогичным выводам ранее пришли Oshima Т. еt al. (2012) - воздействие кислоты на СО пищевода вызывает «делокализацию» клаудин-4 в поверхностном слое пищеводного эпителия [12]. В исследовании Björkman E.V. (2013) была рассмотрена роль щелочного рефлюкса в функциональной состоятельности эпителиального барьера и белков межклеточных контактов эпителия [10]. Установлено, что желчные кислоты и низкие концентрации трипсина увеличивают экспрессию клаудина-1, в то время как высокие - снижают экспрессию Е-кадгерина, клаудина-3 и -4, что позволило авторам сделать выводы, что щелочной рефлюктат повреждает эпителиальный барьер пищевода путем модуляции белков межклеточных контактов [10].

На сегодняшний день среди факторов, приводящих к прогрессированию ГЭРБ, значимым является длительный анамнез заболевания, так как именно продолжительное воздействие рефлюктата приводит к дифференцировке стволовых клеток базальных отделов эпителия в клетки, устойчивого в отношении повреждения, цилиндрического эпителия [13]. Однако о роли молекулярных механизмов межклеточной адгезии в этом процессе известно мало [10]. Так, по данным Swami S. (1995), у пациентов с верифицированным ПБ отмечается снижение мембранной экспрессии молекул межклеточной адгезии, а у пациентов с диспластическими изменениями СО уровень их экспрессии аналогичен таковому при ПБ, однако была зарегистрирована частичная деструкция комплекса Е-кадгерин-катенин, ответственного за целостность цитоскелета, что характеризует грубые нарушения гистоархитектоники эпителия в данной группе больных [14].

Известно, что E-кадгерин (cadherin) - одна из центральных молекул клеточной адгезии в эпителиальных тканях, локализованная на мембране и участвующая в образовании адгезионных контактов, являющихся характерной особенностью этих тканей. Установлено, что в тканях взрослого человека E-кадгерин участвует в формировании эпителиального пласта [10]. При этом две молекулы E-кадгерина, прилегающих к друг другу клеток, соединяются посредством внеклеточного домена, функционирующего исключительно в присутствии ионов Са2+, образуя между ними адгезионные контакты. В немногочисленных экспериментальных исследованиях была показана роль E-кадгерина в обеспечении клеточной пролиферации и дифференцировки [10]. Имеющиеся в настоящее время данные свидетельствуют о том, что функции, связанные с E-кадгерином и β-катенином, играют двойственную роль: с одной стороны, участвуют в формировании межклеточных контактов, а с другой - выступают регуляторами сигнальных путей. По данным ряда авторов [14], изменения экспрессии Е-кадгерина при ГЭРБ, особенно при ее осложненном течении, позволяют рассматривать эту молекулу в качестве раннего маркера прогрессирования заболевания. Так, в исследовании Jovov B. еt al. (2011) установлено, что проницаемость эпителиального барьера зависит от структурной целостности E-кадгерина, расщепление которого, вероятно, является пусковым фактором в патогенезе ГЭРБ. Авторы предположили, что идентификация расщепленных фрагментов молекулы E-кадгерина может быть ценным биомаркером ГЭРБ [15]. Кроме этого, Roy C. Orlando et al. в 2011 г. зарегистрировали патент «E-кадгерин как биомаркер ГЭРБ», показав прямую связь между изменением концентрации концевых N-фрагментов указанного белка в сыворотке крови и тяжестью ГЭРБ. Таким образом, представляется целесообразным рассмотреть эти аспекты более подробно.

Цель: изучить экспрессию отдельных компонентов межклеточных соединений при различных формах ГЭРБ и ПБ.

Настоящее исследование выполнено в период с 2016 по 2017 г. на базе консультативно-диагностической поликлиники и гастроэнтерологического отделения клиники ФГБОУ ВО «РостГМУ». На I этапе проводилось комплексное клиническое обследование по стандартному протоколу для пациентов с ГЭРБ [13]. Диагноз верифицирован с использованием клинико-анамнестических данных, инструментальных методов обследования, включающих: видеоэзофагогастродуоденоскопию с детальным осмотром дистального отдела пищевода в режиме NBI с биопсией и морфологическим исследованием эзофагобиоптатов; 24-часовую внутрипищеводную pH-импедансометрию. Критериями включения пациентов в исследование являлись: амбулаторные и стационарные больные с диагнозом ГЭРБ и ПБ в возрасте от 18 до 55 лет, ограничение приема антисекреторных препаратов в течение 1 мес. Ранжирование больных проводилось в зависимости от результатов 24-часовой внутрипищеводной pH-импедансометрии, демонстрирующих особенности преобладающего характера рефлюктата. Сформированы две исследовательские когорты больных: 1-я группа – 22 пациента (13 женщин и 9 мужчин, средний возраст 44,1±15,3 года) с кислым и слабокислым характером рефлюктата, 2-я группа – 12 больных (4 женщины, 8 мужчин, средний возраст 48,7±12,1 года) с преимущественно щелочным и слабощелочным рефлюксом. В 1-й группе преобладали пациенты с градацией эрозивного эзофагита (ЭЭ) А и В, во 2-й - больные с ЭЭ градации С, D и ПБ (Лос-Анджелесская классификация рефлюкс-эзофагита, 1994) (табл. 1). Группу сравнения составили 20 здоровых добровольцев.

Таблица 1

Распределение пациентов с ГЭРБ в зависимости от градации рефлюкс-эзофагита и характера рефлюктата

На II этапе осуществлялось иммуногистохимическое исследование эзофагобиоптатов по стандартной методике с трептавидин-биотиновым методом с использованием моноклональных мышиных антител к Е-кадгерину (Dako, США). Демаскировку антигена проводили в цитратном буфере с рН 6,0. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера в течение 15–60 с. Количественный анализ экспрессии Е-кадгерина измерялся условными единицами оптической плотности (УЕОП), где низкий уровень экспрессии соответствовал 21-50 УЕОП, умеренный - 51-100 УЕОП, выраженный - более 100УЕОП. У пациентов с ЭЭ экспрессия Е-кадгерина изучалась в аналогичных зонах в краях и в СО вне эрозивно-язвенных дефектов. У пациентов с верифицированным ПБ экспрессия Е-кадгерина оценивалась в вышеуказанных зонах, а также в участках метаплазии эпителия пищевода по кишечному типу с использованием инвертированного микроскопа Leica DMD 108. Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программы Statistiсa 10.0 for Windows (StatSoft, USA).

Результаты

Анализ выраженности и активности воспаления СО пищевода не выявил статистически значимых различий между I и II группой пациентов. Так, в I группе у 12 (54,5%) больных регистрировалось умеренное воспаление слабой активности, у 6 (27,3%) – отмечалось резко выраженное активное воспаление (рисунок) и у 4 (18,2%) – неактивное воспаление. У всех обследуемых II группы также отмечено наличие различной степени выраженности и активности воспаления СО пищевода: у 4 (33%) пациентов – активное и резко выраженное, у 2 (17%) – умеренно выраженное слабой активности. Также следует отдельно выделить 6 (50%) пациентов, у которых диагностирован ПБ (р= 0,45) (табл. 3 А-Г).

Больной С. Рефлюкс кислотного желудочного содержимого. Окраска гематоксилином-эозином. В слизистой оболочке пептическая язва, воспаление выраженной активности

Экспрессия Е-кадгерина в группе здоровых добровольцев регистрировалась на мембране многослойного плоского эпителия, покровного цилиндрического эпителия в зоне кардиоэзофагеального перехода (КЭП), а также в кардиальных железах пищевода и составила: 140,53 ± 10,6 УЕОП; 128,97 ± 9,35 УЕОП; и 121,55± 6,98 УЕОП соответственно, что было принято за диапазон релевантных значений нормальных величин.

При ЭЭ изменение экспрессии Е-кадгерина было зарегистрировано во всех изучаемых образцах вне зон эрозивно-язвенных дефектов: в многослойном плоском эпителии пищевода, покровном цилиндрическом эпителии в зоне КЭП, в кардиальных железах (табл. 2).

Таблица 2

Уровень экспрессии Е-кадгерина у больных с эрозивным эзофагитом в зависимости от характера рефлюктата

* - статистическое различие между показателями у здоровых волонтеров.

В целом по I исследовательской группе зарегистрировано снижение экспрессии Е-кадгерина в многослойном плоском эпителии, в интервале от 96,4+9,23 УЕОП до 127,4+11,6 УЕОП, составившее в среднем по группе 115,3±35,2 УЕОП (табл. 3А). Во II группе наблюдения, при щелочном характере рефлюктата, регистрировались аналогичные статистически значимые изменения экспрессии Е-кадгерина. Так, в среднем по группе зарегистрировано 2-кратное снижение экспрессии изучаемого белка, составившее 72,76±26,88 УЕОП (р=0,019).

Изменения экспрессии Е-кадгерина в покровном цилиндрическом эпителии КЭП имели аналогичную направленность (табл. 3Б). Так, в I и II исследовательских группах констатировано статистически значимое снижение средних значений экспрессии Е-кадгерина, составившее: 89,51±27,64 УЕОП и 44,14±15,90 УЕОП соответственно, что в 1,5 и 2,9 раза было ниже, чем в группе здоровых волонтеров (р=0,005).

В кардиальных железах пищевода в обеих исследовательских группах зарегистрирована минимальная мембранная экспрессия Е-кадгерина, составившая в среднем по группам 34,18±6,70 УЕОП и 28,65 УЕОП соответственно.

Таблица 3

Иммуногистохимическое исследование с антителами к Е-кадгерину. Сравнение экспрессии Е-кадгерина в I и II группах

Сравнение экспрессии Е-кадгерина у пациентов с ПБ также проведено в многослойном плоском, покровном цилиндрическом эпителии КЭП, а также в зонах кишечной метаплазии (табл. 4).

Таблица 4

Уровень экспрессии Е-кадгерина у больных с ПБ в зависимости от характера рефлюктата

* - статистическое различие между показателями у больных с эрозивным эзофагитом.

У пациентов I группы в многослойном плоском эпителии регистрировалось 1,5-кратное снижение экспрессии Е-кадгерина, составившее в среднем по группе 69,11±5,52 УЕОП, в то время как во II группе, при щелочном характере рефлюктата, отмечалось 3-кратное снижение экспрессии изучаемого белка, составившее в среднем по группе 38,52±5,01 УEОП (р=0,019). Более значимое снижение экспрессии Е-кадгерина было констатировано при иммуногистохимическом исследовании покровного цилиндрического эпителия КЭП и в зонах метаплазии по кишечного типу. Так, в группе больных с преимущественно кислым характером рефлюктата средние значения экспрессии Е-кадгерина находились на уровне: 49,2±9,21 УЕОП и 59,98±14,50 УЕОП соответственно. Максимальное снижение экспрессии изучаемого показателя было зарегистрировано у больных с щелочным характером рефлюктата, составившее в среднем по группе 36,38±12,5 УЕОП, что в 2,5 раза было ниже, чем в группе с кислым рефлюксом, и в 3,5 раза ниже, чем у здоровых волонтеров (р=0,17). Аналогичное снижение экспрессии Е-кадгерина зарегистрировано в зонах кишечной метаплазии. Так, в I группе зарегистрировано более чем 2-кратное снижение экспрессии Е-кадгерина, составившее в среднем по группе 59,98±14,50 УЕОП (табл. 3В). В группе больных ЭЭ, ассоциированным с щелочным характером рефлюктата, зарегистрирован минимальный уровень мембранной экспрессии Е-кадгерина, составивший в среднем по группе 28,59±2,66УEОП (р=0,008) (табл. 3Г).

Выводы

1. Эрозивный эзофагит высоких градаций сопровождается значимым снижением экспрессии Е-кадгерина в эпителии пищевода.

2. Резкое снижение экспрессии Е-кадгерина зарегистрировано в многослойном плоском и метаплазированном эпителии у больных с ГЭРБ и ПБ, ассоциированных с преимущественно щелочным рефлюксом.