Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,006

PHENOTYPING THE ORAL MUCOSAL IMMUNOCYTЕS IN THE DENTAL IMPLANTATION DYNAMICS

Reva G.V. 1 Tolmachev V.E. 1 Kulakov A.A. 2 Kalinin I.O. 1 Krasnikov Y.A. 1 Indyk M.V. 1 Kim A.R. 1 Voskanyan O.G. 1 Reva I.V. 1, 3
1 Far East Federal University
2 FSBA Central Research Institute of Dentistry and Maxillofacial Surgery of the Ministry of Health of Russia
3 International medical education and research center
At the present stage, there are only single studies devoted to local factors of immune defense in the dynamics of dental implantation. We have studied biopsies sections of the oral mucosa (OM) on the background dental implantation, with using the classical and immunohistochemical methods of investigation with the further held analysis on the Olympus Bx52 microscope. As a result of morphological monitoring of the structures of the oral mucosa, a model reflecting changes in local immune homeostasis in people without concomitant pathology was presented in the control group of patients, it was noted that with age, the regenerative potential of keratinocytes and ductility of the COP epithelium decreased, the number of effector immunocytes, the number of functioning capillaries and a decrease in the density of the vascular bed in in its own plate from the lining of the mouth. Offered apps for the standard analysis of patients in the clinic of maxillofacial surgery, and diagnostics of the OM local immunity homeostasis state. If cytological signs of deviation in the indices of the homeostasis are found in comparison with the proposed model, reflecting the average statistic indices, as well as the density of the MCR in its own sheet of oral mucosa, further actions should be planned with a prior immunomodulatory correction of the method of treatment.
dental implantation
immune homeostasis
oral mucosa
reactive regeneration
apoptosis
angiogenesis
keratinocytes

В патогенезе осложнений дентальной имплантации важную роль играет реакция на неё иммунной системы [1]. Имплантация вызывает состояние вторичного иммунодефицита, определяемое в первую очередь на организменном уровне [2]. T.J. Giusto, D.J. Conover (2015) проведены исследования, доказывающие генерализованные нарушения функции клеточного и гуморального иммунитета при имплантации [3; 4]. Активность иммунокомпетентных клеток определяет не только предупреждение развития гнойно-некротических изменений тканей, но и процессы эпителизации, ангиогенеза, образования интимных связей имплантата с окружающими тканями [5]. Эти клетки являются регуляторами процессов регенерации. При этом имеются только единичные исследования, посвященные местным факторам иммунной защиты [6-8]. Мониторинговые исследования по изучению сравнительной характеристики местного иммунного статуса при дентальной имплантации практически отсутствуют, а имеющиеся работы выполнены преимущественно в эксперименте на животных [9-11], что определило выбор направления наших исследований.

Цель настоящего исследования заключается в мониторинге изменений локального иммунного гомеостаза слизистой оболочки рта в динамике интеграции имплантатов после дентальной имплантации.

Материал и методы. Исследование проведено в период с 1991 по 2016 год с учётом положений Хельсинкской декларации (с информированного согласия пациентов или, в случае недееспособности, опекунов (2000)), с позволения этического комитета ФГАОУ ВО «Дальневосточный федеральный университет». Все пациенты осмотрены в соответствии с протоколами заполнения медицинских карт стоматологических больных формы № 043/у. По результатам клинического осмотра при необходимости по клиническим показаниям производили забор материала СОР у мужчин, распределённых с учётом возрастных групп, принятых ВОЗ от 16.01.2016. Анализ материала больных проведён с учётом возрастной динамики и длительности сопутствующего заболевания в анамнезе. В обследовании участвовали 123 мужчины в возрастных группах от 20 до 85 лет, имеющие локальные и генерализованные дефекты зубных рядов на фоне атрофии челюстей, с экстирпацией зубов, или потерявших зубы после травм челюстно-лицевой области. В контрольную группу были включены пациенты с частичной адентией без атрофии челюстей после травм (табл. 1).

Таблица 1

Распределение пациентов с патологией

Группа контроля

Молодой возраст

Средний возраст

Пожилой возраст

Старческий возраст

Долголетие

20-44 лет

18-44 года

45-59 лет

60-74 лет

75-90 лет

Старше 90 лет

11

23

45

28

14

1

Итого:

122

 

В качестве контроля исследована СОР мужчин без сопутствующей патологии, утративших в результате травмы один или несколько зубов сразу после травмы, или в период проведения имплантации, так как у женщин показатели СОР имеют зависимость от циркадных ритмов [12].

Всем больным по клиническим показаниям были проведены одно и двухэтапные операции дентальной имплантации. Нами были использованы системы различных имплантатов, которые имеют регистрацию в РФ (Astra Tech, Nobel Bio Care, Bego Semados, Conmet, Alfa Bio, OnewayBiomed), с соблюдением хирургических протоколов операций, утвержденных производителем. Имплантаты применяли для классической двухэтапной и одноэтапной методики имплантации. На современном этапе согласно рекомендациям ВОЗ применяли преимущественно винтовые имплантаты. Морфологические исследования проводили непосредственно после удаления зубов или их корней, имплантации и микрохирургических пародонтологических операций, до и после установки имплантатов способом иссечения фрагментов слизистой оболочки, покрывающей десну объемом 0,5-1 мм3. Забор материала производился во время хирургической или в ранние сроки после травматической экстирпации зубов, при установке имплантатов и формирователей десны, всего изучено 362 среза. Также материал забирали во время подготовки пациента к установке имплантатов (при коррекции атрофии челюстей) и в случае отторжения имплантатов (4 случая за период с 2011 по 2015 г.) для получения полной характеристики взаимодействия эффекторных иммуноцитов в слизистой оболочке рта.

Анализ биопсий проведён с использованием рутинных методик (классического окрашивания гематоксилином и эозином, по Ван Гизону, Victoria blue, по Браше и толуидиновым синим), а также фазовоконтрастной микроскопии. Основными методами морфологических исследований явились иммуногистохимические, с фенотипированием иммуноцитов на основе кластеров дифференцировки (Cluster of Differentiation – CD) - T-лимфоцитов CD4/8, CD34, клеток Лангерганса СD68, интерстициальных макрофагов СD163, тучных клеток CD203a. Интенсивность пролиферативной активности в эпителиальной пластинке оценивалась по индексу митотических ядер с помощью выявления локализации маркера Ki-67 и подсчётом количества митозов на 100 клеток. Апоптоз изучен Тunel методом для световой микроскопии, а для изучения апоптических процессов при подготовке рта и при имплантации получена характеристика локализации р53. Также исследован ассоциированный с проапоптическими факторами маркер ранней клеточной дифференцировки р63. Для статистической обработки результатов использовали специальный пакет прилагаемых компьютерных программ к микроскопу фирмы Olympus Bx52.

Результаты и обсуждение

Мониторинг состояния локального иммунного гомеостаза и пролиферации у пациентов на фоне дентальной имплантации позволил установить, что у пациентов старших возрастных групп наблюдаются изменения характера ороговения: с одной стороны, развивался гиперкератоз, носивший, как правило, защитный характер, с другой - появлялись признаки атрофии и уменьшение рогового слоя в области жевательной поверхности десны и со стороны преддверия рта. Как и в исследованиях Woo S.B., Lin D. [13], наблюдалось нарушение гистоархитектоники слизистой оболочки при гиперкератозе у пациентов старших возрастных групп, что свидетельствовало о нарушениях процессов дифференцировки, а при развитии атрофии – процесса десквамации эпителия. При этом уменьшается пролиферативная активность кератиноцитов, уменьшается плотность микроциркуляторного русла в собственной пластинке слизистой оболочки (рис. 1).

. а б в

г д е

Рис. 1. Слизистая оболочка десны человека: а - безъядерные эпителиоциты у пациентов до 40 лет; б - эпителиоциты у пациентов старше 40 лет; в, г - выявление локализации Ki67;

д - CD68, е - CD34. Микрофото, ув. 200

Безъядерные эпителиальные клетки, идентифицирующиеся в группах до 40 лет, свидетельствуют о нормальных процессах дифференцировки, кератинизации и слущивания. В возрастной группе старше 40 лет увеличивается количество эпителиоцитов, находящихся в состоянии паракератоза, в то время как регенераторный потенциал лучше выражен в группе до 40 лет. Он снижается с возрастом, о чём свидетельствует наличие единичных пролиферирующих клеток в базальном слое эпителия в группах у пациентов старше 40 лет. Антигенпрезентирующие клетки идентифицируются в камбиальных слоях эпителия – базальном и шиповатом, что говорит о высоких барьерных свойствах эпителия. Локализация CD34 показала наличие кровеносных капилляров, максимальное количество которых в поле зрения достигало трёх. Вокруг сосудов отсутствовала инфильтрация лейкоцитов.

Апоптозирующие клетки идентифицируются исключительно в поверхностных слоях, в то время как проапоптические факторы локализуются в шиповатом слое, что свидетельствует о репрессии в геноме локусов, отвечающих за пролиферацию. Макрофаги CD68 выявляются как в эпителиальном слое, преимущественно в базальном слое, так и в прилежащей к эпителию собственной пластинке соединительной ткани (рис. 2).

а ?????_07б в

г д

Рис. 2. Слизистая оболочка рта: а - Tunel-позитивные клетки, б - р53; в - CD163, г - CD4, д - CD8. Микрофото, ув. 200

Соотношение идентифицирующихся эффекторных иммуноцитов CD4 и CD8 (3:1) показало, что локальный иммунный гомеостаз соответствует показателям у здоровых лиц, принятым, по данным большинства исследователей, в качестве возрастной нормы. Расположение специфических Т-супрессоров, способных подавлять иммунный ответ вне зависимости от антигена, в шиповатых слоях эпителия соответствует одной из их главных функций – регуляции клеточной пролиферации.

По анализу результатов морфологического исследования биоптатов слизистой оболочки рта у больных контрольной группы была составлена модель, отражающая нормальное состояние локального иммунного гомеостаза у пациентов без сопутствующей патологии (табл. 2).

Таблица 2

Исходные показатели иммунного гомеостаза слизистой оболочки рта в возрастном аспекте без сопутствующей патологии при обращении и в начале лечения

Возраст, лет

Кол-во клеток в поле зрения (M±m)

МИ

CD163+

CD4+/8+

CD68+

CD203а+

CD34

18-34

1,59±0,45

1,51±0,12

1,09±0,22

1,37±0,11

1,13±0,07

5,47±0,21

35–59

1,39±0,12

1,50±0,14

1,47±0,08

1,34±0,11

1,41±0,10

9,95±0,51

59-74

1,31±0,07

1,31±0,12

0,81±0,05

1,56±0,14

0,91±0,07

3,57±0,23

75-90

1,15±0,09

1,26±0,05

0,75±0,03

1,42±0,06

0,76±0,03

2,89±0,17

Более 90 лет

0,71±0,03

0,92±0,07

0,65±0,02

0,96±0,06

0,55±0,03

2,61±0,15

* Различия данных в возрастных группах являются статистически значимыми (p<0,01).

Примечание. Приведены исходные данные в момент обращения (над чертой) и в начале лечения (под чертой).

Данные таблицы для лучшей наглядности отражены в диаграммах для сравнения количественных показателей с единицей площади (рис. 3, 4). Указана динамика количественных и качественных изменений слизистой оболочки, отражающая мониторинг иммуноцитов и пролиферативной активности в возрастном аспекте.

Рис. 3. Показатели иммунного гомеостаза (ИГ) слизистой оболочки рта. Различия данных в возрастных группах являются статистически значимыми (p<0,01)

Как и в работах других авторов, морфологический анализ при исследовании слизистой оболочки рта показал, что у пациентов без сопутствующей соматической, онкологической, эндокринной и стоматологической патологии, в условиях сохранных зубных рядов, пласт эпителиоцитов представлен 24–27 слоями клеток, базальная мембрана эпителия СОР волнистая, что согласуется с данными Bodineau A., Folliguet M., Séguier S. (2009) [14]. Соединительная ткань собственной пластинки слизистой оболочки однородная, представлена плотно скомпонованными коллагеновыми волокнами с незначительным количеством мелких капилляров и редко идентифицирующимися макрофагами и Т-лимфоцитами. В базальных и поверхностных пластах эпителия контакты между клетками плотные, не идентифицируются межклеточные щели. Микроциркуляторное русло (МЦР) представлено немногочисленными капиллярами, выстланными плоским эндотелием, с отсутствующей перикапиллярной инфильтрацией лейкоцитами. Динамика регенераторного потенциала структур слизистой оболочки в возрастном аспекте представлена на рис. 4.

Рис. 4. Динамика регенераторного потенциала структур слизистой оболочки в возрастном аспекте. Различия данных в возрастных группах являются статистически значимыми (p<0,01)

Заключение. В целом в наших наблюдениях, как и у других авторов [15; 16], у пациентов с возрастом отмечается снижение регенераторного потенциала кератиноцитов, уменьшение количества эффекторных иммуноцитов, что свидетельствует об общей тенденции к снижению барьерных свойств эпителиальной пластинки слизистой оболочки рта. Уменьшение количества функционирующих капилляров и снижение плотности МЦР у пожилых и долгожителей является причиной снижения трофического обеспечения тканей пародонта, что ведёт к атрофии костной ткани челюстей [17].

Анализ полученных данных позволил составить дополнения к принятому в челюстно-лицевой хирургии алгоритму клинической диагностики и обследования пациентов. Так, стандартное обследование было дополнено диагностическими мероприятиями для выявления состояния иммунного гомеостаза слизистой оболочки на основе исследования биоптатов слизистой оболочки рта с предварительным применением метода фазово-контрастной микроскопии. При выявлении количественных морфологических признаков изменений показателей иммунного гомеостаза в сравнении с предложенной моделью, отражающей среднестатистические нормальные возрастные показатели пролиферативной активности кератиноцитов и соотношение эффекторных иммуноцитов, а также плотность МЦР в собственной пластинке слизистой рта, следует планировать тактику дальнейших мероприятий с предварительной иммуномодулирующей корректировкой метода лечения.

Работа выполнена при поддержке научного фонда ДВФУ, в рамках государственных заданий 2014/36 от 03.02.2014 г., 17.5740/2017/6.7 и Международного гранта ДВФУ (соглашение № 13-09-0602-м от 6 ноября 2013 г.).