Сахарный диабет представляет собой сложное полифункциональное заболевание, характеризующееся многообразными метаболическими нарушениями, вызывающими гипергликемию и окислительный стресс, с последующими осложнениями, связанными с дисфункцией β-клеток поджелудочной железы и дефицитом инсулина [1]. При этом нарушаются энергетические процессы во всех видах соединительной ткани, где транспорт глюкозы сугубо инсулинозависимый [2]. Биохимическая особенность межклеточного вещества этой ткани основана на синтезе специфических соединений, таких как углеводсодержащие биополимеры. Основными их представителями в слизистых наложениях желудочно-кишечного тракта являются сиалогликопротеины, важнейшие функции которых – защитная и барьерная [3]. Доказано, что частота поражений слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированных с H.pylori, у больных сахарным диабетом выше по сравнению с пациентами, не имеющими нарушений углеводного обмена [4]. М.В. Ляпиной (2013) выявлено у лиц с инсулинорезистентностью угнетение всех видов пищеварения на фоне воспалительно-дистрофических изменений слизистой оболочки тонкой кишки, а также отмечена тенденция к повышению абсорбции моносахаров. Кроме этого, показано преобладание гипокинетической дискинезии тонкой кишки в постпрандиальном периоде, отмечается брадикинезия двенадцатиперстной кишки со снижением эвакуации и формированием дуоденостаза и дуодено-гастрального рефлюкса [5].
По проведенным исследованиям С.С. Перцова и др. (2009) известно, что среди общей популяции экспериментальных животных имеются индивиды, устойчивые и предрасположенные к стрессу, а в зависимости от их стрессоустойчивости изменения в обмене биополимеров соединительной ткани могут быть различны [6]. Индивидуальная стрессочувствительность организма во многом определяется генетически обусловленным состоянием так называемых стресс-лимитирующих систем, к которым относят в том числе дофаминергическую и серотонинергическую системы [7]. Ранее показано, что у крыс линии Август по сравнению с крысами Вистар более высокая устойчивость к стрессорному язвообразованию гастродуоденальной зоны сочетается с более высоким базальным и постстрессорным (после острого стресса) содержанием серотонина в стриатуме, что послужило одним из экспериментальных оснований отнесения серотонинергической системы к числу стресс-лимитирующих систем [8]. Важными участниками этих процессов являются нейропептиды. Они играют роль триггеров срочной мобилизации, модуляторов состояния системы нейрогуморальной регуляции неспецифических и специфических адаптивных функций организма, сохраняя запасы норадреналина и снижая накопление продуктов перекисного окисления липидов в тканях. Одним из синтетических аналогов лей-энкефалинов, энзиморезистентного агониста мю- и дельта-рецепторов является даларгин, оказывающий на обмен соединительной ткани протективный эффект. Это связано со способностью препарата вызывать пролиферацию, а в последующем быструю дифференцировку фибробластов с усилением секреции биополимеров соединительной ткани. Кроме этого, было доказано, что даларгин ограничивает действие стрессреализующих систем [9, 10].
Цель работы: проанализировать обмен сиалогликопротеинов в тканях тонкой кишки крыс с различной устойчивостью к стрессу при введении даларгина в условиях экспериментального сахарного диабета.
Материалы и методы исследования
Опыты проводились на 85 белых беспородных крысах-самцах массой 180–230 г, 43 из которых составляли группу стрессонеустойчивых (СНУ) и 42 – стрессоустойчивых (СУ) животных. С целью прогностической оценки устойчивости животных к стрессогенным воздействиям использовали тест «открытое поле» по методу С.С. Перцова (2009) [6]. При этом соблюдались положения Хельсинской декларации о гуманном отношении к лабораторным животным (одобрительная форма комитета по биомедицинской этике от 24 февраля 2009 г., аппликационный № 153). Экспериментальный сахарный диабет моделировали посредством однократной подкожной инъекции аллоксана тетрагидрата (мезоксалилмочевина, «Fluka Chemika», Швеция) в дозе 170 мг/кг массы тела животного по методике Н.А. Пальчиковой и соавт. (1987). В ходе эксперимента отмечалась гибель животных: среди СНУ 2 крысы погибли на четвертый день, а у СУ отмечалось аналогичное количество летальных исходов на третий день наблюдения, что может быть связано с острым стрессорным воздействием аллоксана в первые сутки и развитием декомпенсации на фоне гипергликемии. Для выяснения роли опиоидных пептидов в регуляции обмена сиалогликопротеинов при экспериментальном аллоксановом диабете (АД) использовали препарат даларгин – синтетический аналог лей-энкефалина (ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, Россия), разведенный в стерильном 0,9%-ном растворе натрия хлорида (0,25М), который вводили внутримышечно по схеме: через каждые 72 часа, в дозе 100 мкг/кг массы тела крысы на протяжении 45 дней. Контрольную группу составили 8 СНУ и 8 СУ интактных крыс, содержащихся на обычном рационе вивария, которым вводили внутримышечно 0,2 мл физиологического раствора в динамике, аналогичной опытной группе.
Обмен сиалогликопротеинов (СГП) оценивали по уровню свободных сиаловых кислот (ССК), олигосвязанных сиаловых кислот (ОССК), белковосвязанных сиаловых кислот (БССК), интегрального показателя (БССК/ССК+ОССК) и сиалидазной активности (СА) в сыворотке, слизистой оболочке и стенке тонкой кишки на 10-й, 20-й, 30-й, 45-й и 60-й дни эксперимента. Полученные в ходе исследования показатели проанализированы с помощью непараметрических методов количественной оценки критерия Манна–Уитни с достоверностью pк-1<0,05. Результаты представлены в виде медианы (Me), нижнего (Q25) и верхнего (Q75) квартилей. Коэффициент корреляции оценивали по методике Спирмена с достоверностью p1-2<0,01.
Результаты исследования и их обсуждение
Из таблицы 1 видно, что количество свободных сиаловых кислот в сыворотке крови СНУ животных при инъекции даларгина в условиях гипергликемии максимально возрастало на 45-й день эксперимента. Уровень олигосвязанных сиаловых кислот не изменялся на протяжении всего опыта, а количество белковосвязанных сиаловых кислот в сыворотке крови увеличивалось в динамике опытов с максимальным ростом на 30-й и 45-й дни. Одновременно отмечался рост сиалидазной активности с максимумом к 20-му дню эксперимента на 100,0%.
Достоверных изменений в содержании свободных и олигосвязанных сиаловых кислот в сыворотке крови СУ животных в течение всего экспериментального наблюдения не выявлено. Концентрация белковосвязанных сиаловых кислот возрастала в течение всей динамики с преобладанием на 30-й и 45-й дни на 85,4 и 100,9% соответственно. Уровень сиалидазной активности на 20-й день был на 66,7% выше контрольных значений (табл.).
Показатели обмена сиалогликопротеинов в сыворотке крови крыс с различной устойчивостью к стрессу при введении даларгина на фоне аллоксанового диабета
(Me [Q25-Q75], n=8)
|
показатели |
контроль |
дни опыта |
||||
|
10 |
20 |
30 |
45 |
60 |
||
|
рк-10 |
рк-20 |
рк-30 |
рк-45 |
рк-60 |
||
|
стрессонеустойчивые |
||||||
|
ССК, ммоль/л |
0,07 [0,05– 0,07] |
0,09 [0,07– 0,10] (р=0,10928) |
0,04 [0,03– 0,08] (р=0,12246) |
0,10 [0,05– 0,11] (р=0,39802) |
0,10 [0,08– 0,12]* (р=0,02607) |
0,08 [0,05– 0,10] (р=0,12499) |
|
ОССК, ммоль/л |
0,24 [0,18– 0,25] |
0,16 [0,14; 0,20] (р=0,11384) |
0,27 [0,24; 0,30] (р=0,14060) |
0,21 [0,18; 0,23] (р=0,26802) |
0,25 [0,21; 0,27] (р=0,56150) |
0,17 [0,16; 0,20] (р=0,17090) |
|
БССК, ммоль/л |
2,21 [2,20– 2,23] |
3,27 [3,24; 3,30]* (р=0,00108) |
2,79 [2,77; 2,80]* (р=0,01141) |
3,75 [3,65; 3,79]* (р=0,00075) |
4,10 [4,08; 4,15]* (р=0,00074) |
3,42 [3,36; 3,49]* (р=0,00110) |
|
СА, ммоль/л/ч |
0,03 [0,02– 0,04] |
0,05 [0,03– 0,05] (р=0,10051) |
0,06 [0,02– 0,06]* (р=0,02674) |
0,04 [0,02– 0,04] (р=0,24590) |
0,04 [0,01– 0,04] (р=0,14001) |
0,03 [0,02– 0,04] (р=0,26553) |
|
стрессоустойчивые |
||||||
|
ССК, ммоль/л |
0,05 [0,04– 0,06] |
0,06 [0,02– 0,07] (р=0,45209) |
0,05 [0,03– 0,06] (р=0,55707) |
0,07 [0,06– 0,09] (р=0,08976) |
0,07 [0,05– 0,10] (р=0,18566) |
0,05 [0,02– 0,06] (р=1,00000) |
|
ОССК, ммоль/л |
0,20 [0,16– 0,23] |
0,13 [0,12– 0,16] (р=0,07229) |
0,22 [0,20– 0,25] (р=0,24520) |
0,17 [0,15– 0,21] (р=0,39907) |
0,24 [0,21– 0,25] (р=0,12668) |
0,18 [0,14– 0,20] (р=0,36812) |
|
БССК, ммоль/л |
2,19 [2,17– 2,22] |
3,40 [3,38– 3,44]* (р=0,00075) |
2,58 [2,55– 2,60]* (р=0,01153) |
4,06 [4,02– 4,08]* (р=0,00077) |
4,40 [4,38– 4,42]* (р=0,00075) |
3,68 [3,59– 3,74]* (р=0,00075) |
|
СА, ммоль/л/ч |
0,03 [0,01– 0,04] |
0,04 [0,02– 0,04] (р=0,13943) |
0,05 [0,02– 0,06]* (р=0,01541) |
0,04 [0,02– 0,04] (р=0,26731) |
0,03 [0,02– 0,03] (р=0,52616) |
0,03 [0,02– 0,03] (р=0,52647) |
Примечание: * – статистическая значимость различий между опытом и контролем
Метаболизм сиалогликопротеинов в мукозном слое тонкой кишки у СНУ крыс при введении даларгина на фоне экспериментального аллоксанового диабета характеризовался ростом свободных сиаловых кислот на 10-й и 20-й дни опыта соответственно на 44,1% (р=0,0053) и 20,6% (р=0,0154) от контроля. При этом показатель олигосвязанных сиаловых кислот в динамике не отличался от значений интактных животных, а уровень белковосвязанных сиаловых кислот повышался на протяжении всего эксперимента. Рост сиалидазной активности в интестинальной слизи наблюдался на 10-й и 45-й дни воздействия, а именно на 67,6% и 91,2% по отношению к контролю. Интегральный показатель достоверно увеличивался на 30-й день введения даларгина на фоне метаболического стресса на 21,7% (рис. 1).
В группе СУ животных показатели обмена сиалогликопротеинов в интестинальном мукозном слое характеризовались снижением количества ССК к 20-му дню на 38,9% (р=0,0085) по сравнению с контрольным значением 0,36 [0,34;0,38] ммоль/кг сырой ткани. Количество олигосвязанных сиаловых кислот в динамике сочетанного воздействия не изменялось, а уровень белковосвязанных сиаловых кислот увеличивался максимально к 20-му и 30-му дням на 11,1 и 13,1% (р=0,0011) соответственно. При этом соотношение БССК/ССК+ОССК в динамике эксперимента не изменялось (рис. 1). Параллельно с этим отмечался достоверный максимальный рост сиалидазной активности в сравнении со значением интактных крыс на 45-й день, что составило 0,43 [0,41;0,48] ммоль/кг/ч (р=0,0309).
В группе СНУ крыс в стенке тонкой кишки количество свободных сиаловых кислот возрастало только к 10-му дню эксперимента на 27,8% (р=0,0231) от контроля, составив 0,18 [0,16;0,19] ммоль/кг сырой ткани. Концентрация олигосвязанных сиаловых кислот снижалась лишь на 30-й день опыта на 20,4% (р=0,0272) и была равна 1,68 [1,44;1,75] ммоль/кг, а уровень белковосвязанных сиаловых кислот достоверно уменьшался на 10-й и 45-й дни с 7,90 до 7,45 и 7,62 ммоль/кг сырой ткани соответственно. Метаболический оборот в обмене сиалогликопротеинов тонкой кишки у СНУ крыс подтверждают изменения показателя соотношения (БССК/ССК+ОССК), который снижался на 10-й день на 14,3%, а к 30-му дню возрастал на 20,7% (р=0,0086) (рис. 2). Одновременно отмечался достоверный рост сиалидазной активности на 45-й день опыта на 39,1%.
Рис. 1. Изменение интегрального показателя (БССК/ССК+ОССК) в слизистых наложениях тонкой кишки у СНУ и СУ животных при введении даларгина на фоне экспериментального диабета
Обозначения: СНУ – стрессонеустойчивые животные, СУ – стрессоустойчивые животные.
Статистическая значимость между опытом и контролем: * – р<0,05.
Рис. 2. Изменение интегрального показателя (БССК/ССК+ОССК) в стенке тонкой кишки у СНУ и СУ животных при введении даларгина на фоне экспериментального диабета
Обозначения: СНУ – стрессонеустойчивые животные, СУ – стрессоустойчивые животные.
Статистическая значимость между опытом и контролем: * – р<0,05.
В стенке тонкой кишки у СУ крыс отмечалось статистически значимое уменьшение свободных сиаловых кислот к 30-му дню сочетанного воздействия на 38,9% (р=0,0114). При этом показатель олигосвязанных сиаловых кислот превышал контрольное значение на 10-й день на 8,0% (р=0,0062). Уровень белковосвязанных сиаловых кислот статистически значимо снижался на 45-й и 60-й дни на 1,9% и 3,8% соответственно от исходного количества 7,90 [7,86; 7,94] ммоль/кг. На 10-й и 45-й дни опыта показатель соотношения (БССК/ССК+ОССК) уменьшался соответственно на 7,5% (р=0,0157) и 13,1% (р=0,0209), что визуализирует активность процессов распада анализируемых биополимеров (рис. 2).
В обмене плазменных сиалосодержащих гликопротеинов в исследуемых группах животных при введении даларгина на фоне метаболического стресса, вызванного аллоксаном, наблюдалось преобладание процессов синтеза над распадом в динамике наблюдения, кроме 20-го дня эксперимента. А в тканях тонкой кишки СНУ крыс анаболизм сиалогликопротеинов превалировал с 30-го дня опыта. Изменения в обмене сиалогликопротеинов в тканях тонкой кишки в различных по стрессоустойчивости группах животных, находящихся в условиях диабета с одновременным введением даларгина, носили неодинаковый характер: в слизистых наложениях преобладали процессы накопления изучаемых соединений, в особенности в группе СУ животных, а в стенке, наоборот, отмечалась активация реакций катаболизма сиалогликопротеинов в группе СНУ и в группе СУ крыс с 10-го дня динамики наблюдения.
Известно, что автономная нейропатия и состояние окислительного стресса при сахарном диабете приводят к нарушению обмена полиненасыщенных жирных кислот и возникновению дефицита производных арахидоновой кислоты, обладающих вазодилатирующей активностью, снижению уровня восстановленного глутатиона, а также окиси азота как естественных факторов антиоксидантной защиты органов желудочно-кишечного тракта [11]. Изученные нами на этом фоне выраженные биохимические сдвиги в метаболизме гликопротеинов тонкой кишки могут, вероятно, способствовать развитию интестинальной патологии при диабете. Одновременно с этим анаболическое действие даларгина на обмен сиалогликопротеинов может быть связано с повышенной чувствительностью дельта-опиоидных рецепторов у пациентов с данной нозологией. Литературные данные свидетельствуют о возможности их сопрягаться с аденилатциклазой и ингибировать ее [12], предупреждая увеличение цАМФ, но при этом способствовать возрастанию активности цГМФ, а это в свою очередь стимулирует пролиферацию клеток [13]. Вероятно, вышеописанные механизмы объясняют наблюдаемое в наших опытах интенсивное накопление сиалогликопротеинов в тканях тонкой кишки, что может сыграть не последнюю роль в лечебно-профилактических мероприятиях гастродуоденальной патологии у лиц с оксидативным стрессом.