Нормальное функционирование организма здорового человека определяется комплексом социальных и экологических факторов, вызванных качественными и количественными изменениями длительности светового дня. Недостаток света или его наличие в часы сна отражается на функционировании многих органов человека и животных [1].
Нарастающая урбанизация населения несет в себе негативные воздействия, проявляющиеся нарушением сна у населения мегаполисов в условиях излишней освещенности [1]. При нарушении циркадных ритмов происходит снижение уровня мелатонина, и это проявляется нарушением в работе эндокринной системы, действуя на деятельность щитовидной железы через гипоталамо-гипофизарную систему [2]. Длительное воздействие избыточной освещенности на организм человека в конечном счете должно смениться адаптацией организма к изменившимся условиям, однако это происходит не всегда. Результаты адаптационной способности позволяют судить о характере воздействий на организм, функциональном состоянии его нервной системы, динамике соматовегетативных и поведенческих реакций.
Исходя из актуальности целями настоящего исследования являются изучение поведенческой реактивности белых крыс-самцов в условиях измененного фотопериодизма и оценка степени выраженности изменений.
Материалы и методы исследования
Экспериментальное исследование было выполнено на базе научной лаборатории кафедры нормальной физиологии им. И.А. Чуевского Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского согласно принципам биоэтики и правилам лабораторной практики, Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в эксперименте и в других научных целях (Страсбург, 1986 г.) ETS № 123, Приказу МЗ РФ от 19.06.2003 № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики», «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ВОЗ, Женева, 1985), «Правилам лабораторной практики» (Приказ Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708н) и с одобрения этического комитета ФГБОУ ВО Саратовского ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России (протокол от 06.12.2016 № 4).
Эксперимент был выполнен на 36 интактных нелинейных белых крысах-самцах массой 200–250 г, разделенных на 2 экспериментальные группы: контрольную и опытную, по 18 животных в каждой. Крысы находились в одинаковых условиях и на нормальном рационе питания. Животные опытной экспериментальной группы в свою очередь на 1-е, 10-е и 21-е сутки подвергались тестированию в экспериментальных установках.
Из существующих способов моделирования светового режима была выбрана модель изменения фоторежима LD 18/6 – 18 часов света и 6 часов темноты [3, 4].
Для оценки поведенческой реактивности животных в условиях стресса были использованы тест-модели «Темно-светлая камера» и «Открытое поле». Длительность тестирования в каждой из установок составляла 5 минут.
Модель «Темно-светлая камера» позволяет дать оценку, какая интенсивность освещения под воздействием стрессора является для животных комфортной. Установка подразделяется на два отсека – темный и светлый, между которыми находится отверстие прямоугольной формы. В ходе эксперимента изначально животное помещалось в светлую зону камеры, а темная зона оставалась открытой. Оценивались такие показатели, как число и латентный период выглядываний из темного отсека в светлый через отверстие в перегородке, количество и длительность выходов в светлый отсек и неспецифический показатель «Число актов дефекации» – количество экскрементов, обнаруженных в темной зоне камеры по окончании проведения теста [3].
Тест «Открытое поле» позволяет дать оценку выраженности и динамике отдельных компонентов поведенческих реакций животных, помещенных в открытое пространство (арену), в условиях стресса: степени эмоционально-поведенческой реактивности крыс, их исследовательской деятельности, оборонительному поведению, общей двигательной активности. В данной установке мы регистрировали такие специфические показатели, как горизонтальная и вертикальная двигательная активность, число заглядываний в норки и обнюхивание отверстий. Также учитывались число актов дефекации, частота актов и суммарная продолжительность груминга (с), являющиеся неспецифическими компонентами поведения животных [5].
На 21-е сутки животных выводили из эксперимента путем передозировки наркозом (внутримышечная комбинация Телазола (ZoetisInc, США) в дозе 0,1 мл/кг и Ксиланита (Нита-Фарм, Россия) в дозе 0,3 мл/кг).
Статистическая обработка полученных в ходе эксперимента результатов производилась с помощью пакета программ Statistica 10.0 (Statsoft, USA). Данные статистического анализа представлены в виде медианы и квартильного диапазона. Для сравнения значений использовался непараметрический показатель – U-критерий Манна–Уитни, так как выборка не соответствует закону нормального распределения. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.
Результаты исследования
По результатам теста «Темно-светлая камера» можно судить о том, что на 1-е сутки эксперимента у животных опытной группы по сравнению с животными группы контроля было выявлено статистически значимое увеличение специфического показателя «Длительность выглядываний из темного отсека в светлый» (p1=0,000246) и снижение специфического показателя «Длительность выходов из темного отсека в светлый» (p1=0,000220). Происходит развитие стадии тревоги как компонента стрессорной реакции организма животных.
На 10-е сутки интенсивного светового воздействия у животных опытной группы по сравнению с группой контроля наблюдается ослабление локомоторной активности, что выражается в достоверном снижении таких специфических показателей, как «Количество выходов из темного отсека в светлый» (p1=0,003550) и «Длительность выходов из темного отсека в светлый» (p1=0,000592). При сравнении животных опытной группы на 1-е и 10-е сутки эксперимента прослеживаются дальнейшее снижение двигательной активности и усиление стрессового повреждения организма, которое проявляется статистически достоверным снижением показателей «Количество выходов из темного отсека в светлый» (p2=0,002) и «Длительность выходов из темного отсека в светлый» (p2=0,023).
На 21-е сутки эксперимента по сравнению с группой контроля сохраняется статистически значимое снижение специфических показателей «Количество выходов из темного отсека в светлый» (p1=0,001354) и «Длительность выходов из темного отсека в светлый» (p1=0,000037). У животных опытной группы при сравнении показателей на 1-е и 21-е сутки эксперимента прослеживается тенденция к ослаблению поведенческой реактивности, отмечается статистически достоверное снижение специфических и неспецифических показателей: «Длительность выглядываний из темного отсека в светлый» (p3=0,000196), «Количество выходов из темного отсека в светлый» (p3=0,000592), «Длительность выходов из темного отсека в светлый» (p3=0,022577), «Количество актов дефекации» (p3=0,046000). При сравнении показателей у животных опытной группы на 10-е и 21-е сутки эксперимента статистически значимых изменений не наблюдается, кроме неспецифического показателя «Количество актов дефекации» (p4=0,010194), который статистически достоверно увеличивается, что говорит об увеличении уровня тревожности на фоне стресса. Имеется тенденция к снижению показателя «Длительность выглядываний из темного отсека в светлый».
При изучении результатов теста «Открытое поле» выявлено, что на 1-е сутки наблюдения у животных опытной группы по сравнению с животными группы контроля наблюдается статистически достоверное изменение значений показателя «Количество заглядываний в норки» (p1=0,011075), все остальные показатели имеют тенденцию к снижению, что свидетельствует об ослаблении локомоторной активности и ориентационно-исследовательской деятельности в условиях стресса.
На 10-е сутки у животных опытной группы по сравнению с животными группы контроля выявлено статистически достоверное снижение таких специфических показателей, как «Количество пересеченных квадратов» (p1=0,007912), «Количество стоек» (p1=0,001823), «Количество заглядываний в норки» (p1=0,006657), а также неспецифического показателя «Количество актов дефекации» (p1=0,040405). Происходит угнетение поведенческой реактивности животных под воздействием стрессора. Кроме того, аналогичная динамика прослеживается при сравнении животных опытной группы на 1-е и 10-е сутки эксперимента. Наблюдается статистически значимое увеличение показателей «Количество пересеченных квадратов» (p2=0,000139), «Количество стоек» (p2=), «Количество заглядываний в норки» (p2=0,000037), «Количество актов дефекации» (p2=0,005584).
На 21-е сутки наблюдения у животных опытной группы по сравнению с животными группы контроля достоверно снижаются показатели «Количество стоек» (p1=0,008616) и «Количество заглядываний в норки» (p1=0,035090). При сравнении показателей у животных опытной группы на 1-е и 21-е сутки эксперимента отмечается угнетение поведенческой реактивности, что выражается статистически значимым снижением таких специфических показателей, как: «Количество пересеченных квадратов» (p3=0,004669) и «Количество стоек» (p3=0,001823), остальные показатели имеют тенденцию к снижению. У животных опытной группы при сравнении показателей на 10-е и 21-е сутки наблюдения отмечается статистически достоверный рост значений «Количество пересеченных квадратов» (p4=0,009375) и «Количество актов дефекации» (p4=0,005584). У остальных специфических и неспецифических показателей прослеживается тенденция к увеличению значений.
Проведенный статистический анализ позволяет сделать заключение, что при моделировании светового десинхроноза с использованием модели фоторежима 18:6 у экспериментальных животных возрастает уровень тревожности, развиваются стрессорные повреждения организма.
Таблица 1
Показатели поведенческих реакций белых крыс-самцов при использовании теста «Темно-светлая камера» на различных стадиях развития светового десинхроноза при режиме освещения 18:6
Показатель
Группа |
Контроль |
Опытная группа (1-е сутки) |
Опытная группа (10-е сутки) |
Опытная группа (21-е сутки) |
Количество выглядываний из темного отсека в светлый |
2,0 (2,0;3,0) |
2,0 (2,0;4,5) P1 = 0,078253 |
2,0 (1,0;6,5) P1 = 1,000000 P2 = 0,386477 |
2,5 (1,0;4,0) P1 = 1,000000 P3 = 0,174854 P4 = 0,665006 |
Длительность выглядываний из темного отсека в светлый |
5,0 (2,0;11,0) |
30,0 (19,0;42,0) P1 = 0,000246 |
9,5 (1,0;81,5) P1 = 0,370845 P2 = 0,506721 |
6,0 (3,0;8,0) P1 = 0,930988 P3 = 0,000196 P4 = 0,236585 |
Количество выходов из темного отсека в светлый |
1,0 (1,0;2,0) |
1,5 (1,0;2,0) P1 = 0,665006 |
0 (0;1,0) P1 = 0,003550 P2 = 0,001823 |
0 (0;1,0) P1 = 0,001354 P3 = 0,000592 P4 = 0,930988 |
Длительность выходов из темного отсека в светлый |
26,5 (22,0;36,0) |
12,0 (6,0;16,5) P1 = 0,000220 |
0 (0;11,0) P1 = 0,000592 P2 = 0,022577 |
0 (0;13,0) P1 = 0,000037 P3 = 0,022577 P4 = 0,839860 |
Количество актов дефекации |
0,5 (0;1,0) |
0 (0;1,0) P1 = 0,506721 |
0 (0;0) P1 = 0,088535 P2 = 0,312322 |
1,5 (0;3,0) P1 = 0,088535 P3 = 0,046000 P4 = 0,010194 |
Примечание: в каждом случае приведены медиана, нижний и верхний квартили. p1 – различия опытной группы на 1-е, 10-е, 21-е сутки эксперимента по сравнению с группой контроля; p2 – различия между опытными группами на 1-е и 10-е сутки эксперимента, p3 – различия между опытными группами на 1-е и 21-е сутки эксперимента; p4 – различия между опытными группами на 10-е и 21-е сутки эксперимента |
Таблица 2
Показатели поведенческих реакций белых крыс-самцов при использовании теста «Открытое поле» на различных стадиях развития светового десинхроноза при режиме освещения LD 18:6
Показатель
Группа |
Контроль |
Опытная группа (1-е сутки) |
Опытная группа (10-е сутки) |
Опытная группа (21-е сутки) |
Количество пересеченных квадратов |
36,5 (22,0;46,0) |
35,0 (29,0;41,5) P1 = 0,817361 |
17,0 (13,0;21,0) P1 = 0,007912 P2 = 0,000139 |
25,0 (22,0;28,0) P1 = 0,204025 P3 = 0,004669 P4 = 0,009375 |
Количество стоек |
10,0 (4,0;22,5) |
6,0 (4,5;9,5) P1 = 0,355612 |
1,0 (0,5;2,5) P1 = 0,001823 P2 = 0,000139 |
2,5 (1,0;3,5) P1 = 0,008616 P3 = 0,001823 P4 = 0,285477 |
Количество актов дефекации |
0,5 (0;2,0) |
0 (0;1,0) P1 = 0,452921 |
2,5 (1,0;3,0) P1 = 0,040405 P2 = 0,005584 |
0 (0;1,0) P1 = 0,953960 P3 = 0,971115 P4 = 0,005584 |
Количество актов груминга |
1,5 (0;3,0) |
0,5 (0;1,0) P1 = 0,214495 |
0 (0;1,0) P1 = 0,193932 P2 = 0,686106 |
0 (0;2,5) P1 = 1,000000 P3 = 0,587023 P4 = 0,817361 |
Общая продолжительность груминга |
2,0 (0;13,5) |
1,0 (0;3,5) P1 = 0,386477 |
0 (0;4,0) P1 = 0,184210 P2 = 0,583361 |
0 (0;20,0) P1 = 0,976970 P3 = 0,637831 P4 = 0,252761 |
Количество заглядываний в норки |
5,0 (3,0;6,5) |
5,0 (5,5;11,0) P1 = 0,011075 |
2,0 (0,5;3,0) P1 = 0,006657 P2 = 0,000037 |
2,5 (0,5;4,0) P1 = 0,035090 P3 = 0,000097 P4 = 0,470487 |
Примечание: в каждом случае приведены медиана, нижний и верхний квартили. p1 – различия опытной группы на 1-е, 10-е, 21-е сутки эксперимента по сравнению с группой контроля; p2 – различия между опытными группами на 1-е и 10-е сутки эксперимента, p3 – различия между опытными группами на 1-е и 21-е сутки эксперимента; p4 – различия между опытными группами на 10-е и 21-е сутки эксперимента |
Обсуждение результатов исследования
Помещение животного в новые для него условия сопровождается возникновением исследовательского поведения, которое тормозят условия, вызывающие опасность и страх. Это выражается в увеличении на 1-е сутки эксперимента таких показателей, как «Длительность выглядываний из темного отсека в светлый» и «Количество заглядываний в норки».
При длительной световой депривации развивается световой десинхроноз, который приводит к нарушению когнитивных и двигательных процессов у животных
Снижение показателей поведенческой активности пространственной ориентации и развитие тревожности у животных на 10-е сутки десинхроноза можно объяснить тем, что круглосуточное освещение является стрессорным фактором [6]. В дальнейшем должна происходить постепенная частичная адаптация животных к нарушенному циркадному ритму благодаря тесной связи мелатонина и уровня освещенности [4].
Циркадные ритмы организма находятся под влиянием супрахиазматического ядра, расположенного в гипоталамусе [7], который в свою очередь контролирует синтез мелатонина [8]. В результате светового десинхроноза как стрессорного фактора наблюдается снижение секреции гормона эпифиза мелатонина, регулирующего функционирование систем организма, поскольку именно в ночные часы – период наименьшей освещенности – вырабатывается большая часть его суточного количества (до 70%). Недостаток гормона вызывает повышение уровня катехоламинов в крови. В результате длительного стресса под действием катехоламинов снижается сигнализация нейронов гиппокампа – развивается дефицит когнитивных функций на 21-е сутки [9], нарушаются внимание, восприятие и исследовательская активность [3].
Длительное воздействие источников искусственного света на организм человека может приводить к стойкому продолжительному снижению работоспособности, поэтому следует считать необходимым грамотное нормирование светового режима работающего населения.
Данные наших исследований согласуются с результатами других авторов изменений когнитивной функции при экспериментальном десинхронозе в условиях световой депривации, работоспособности и поведенческой активности крыс в «Открытом поле» после световой или темновой деприваций [10].
Выводы
Таким образом, по результатам проведенного исследования необходимо сделать следующие выводы.
- Световой десинхроноз, возникающий при длительной и интенсивной световой депривации, приводит к изменению поведенческих реакций белых крыс-самцов, который носит постепенный характер.
- В ходе анализа полученных результатов можно отметить, что у испытуемых животных с воздействием стрессора к 1-м суткам не наблюдалось выраженных изменений в поведенческой активности, на 10-е сутки все специфические показатели достигают максимальных значений, а на 21-е сутки наблюдается угнетение поведенческой реактивности животных. Это выражается снижением значений исследуемых показателей и повышением уровня тревожности.
- Постоянное нарушение поведенческих реакций животных на всем протяжении эксперимента говорит об отсутствии адаптации животных к интенсивной световой депривации и при длительном воздействии света носит необратимый характер.
Если провести параллель между продолжительностью жизни крыс-самцов и человека, можно сказать, что длительное воздействие источников искусственного света на организм человека может приводить к стойкому продолжительному снижению работоспособности вплоть до срыва адаптационных возможностей организма.