Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

На современном этапе клиники травматолого-ортопедического профиля исследуют состояния иммунной системы, и это является неотъемлемой составной частью предоперационного обследования, послеоперационного ведения пациентов и даже периода реабилитации. Несмотря на то что состояние иммунной системы играет весомую роль при реакции организма на травматическое повреждение, многими травматологами и ортопедами уделяется недостаточно внимания этим показателям. Исследованию изменений показателей клеточного и гуморального иммунитетов посвящено огромное количество публикаций, и эти моменты довольно широко освещены в современной литературе. Однако эти данные фрагментарны, не систематизированы и не имеют подробного анализа, что делает эту проблему весьма актуальной. Также четко определено, что воздействие на организм травмирующего агента определяет не только формирование механического повреждения, но и включает каскад реактивных изменений, в том числе и со стороны иммунной системы [1]. На современном этапе активность хирургов-травматологов обусловлена тем, что профильные клиники оснащены современными высокотехнологичными аппаратами и инструментами, которые позволяют травматологам и ортопедам проводить сложные и объёмные оперативные вмешательства на костях и суставах. Однако при этом наблюдается неоднозначное влияние операций на костно-мышечной системе на гомеостатические показатели организма животных на всех этапах лечения, начиная с момента операции и вплоть до окончания реабилитационных процедур. Также доказано, что деятельность компонентов иммунной системы опосредованно воздействует на репаративные возможности, не оставляя в стороне процессы регенерации костной ткани. Известно, что иммунная система оказывает непосредственное воздействие на интенсивность и характер процессов репарации тканей и органов, в том числе и костной [2]. Параллельно факторы высокогорья определяют особенности компенсаторно-регенеративных и приспособительных возможностей любой системы организма экспериментального животного. Это положение исходит из того, что все системы и органы и их функциональная активность находятся в тесном взаимоотношении с факторами окружающей среды, в которых существует данное животное [3]. Ответная реакция организма на комплексное воздействие факторов высокогорья и смоделированного закрытого перелома характеризуется активацией и высвобождением пептидов, цитокинов а также протеаз в больших концентрациях, которые участвуют в регуляторных механизмах [4]. Причем в разные сроки адаптации к условиям высокогорья и в зависимости от сроков консолидации костной ткани концентрация этих клеток и их фенотипическое различие претерпевают фазные изменения. Параллельно включается каскадная реакция последовательных изменений, обеспечивающих переход доминирующих функций от одних видов клеток к следующим. Одновременно каждый этап определяет интенсивность и выраженность последующих этапов. При этом запускается каскадный механизм, в результате которого предыдущий этап обеспечивает подготовку и функционирование последующих этапов, параллельно обеспечивая выраженность и степень ее реализации [5]. Установлено, что активные цитокины вырабатываются эндотелиальным слоем сосудистой стенки во время их травматизации, а также продуцируются иммунными клетками, мобилизующимися из общего кровеносного русла к месту повреждения (перелома) и окружающие его мягкие ткани вследствие повышения проницаемости сосудистой стенки [6]. При этом концентрация определенных в период кратковременной адаптации к условиям высокогорья иммунных клеток обуславливает характер дальнейшей иммунной реакции организма в ответ на комплексное воздействие травмы и факторов высокогорья [7].

Успехи, достигнутые в иммунологии в начале XX века, позволяют провести изучение состояния иммунной системы более досконально, и при этом немаловажная роль уделяется   особенностям клеточного звена иммунитета. Так, по методике с применением монолокальных антител можно исследовать основные субпопуляции лимфоцитов. Любое повреждение сопровождается формированием различных иммунных реакций, которые объединены в иммунологические синдромокомплексы. Выделяют следующие виды синдромов: синдром аутоиммунного и аутоагрессивного ответов, синдром вторичного иммунодефицита, а также синдром асимметрии иммунного ответа [8]. Формирование иммунологических дисфункций является отличительным признаком течения приспособительных реакций при воздействии на организм травмирующего агента. Формирование дисбаланса между про- и антивоспалительными цитокинами в большей степени зависит от развития Т-клеточных дисфункций. На современном этапе данная проблема не потеряла свою активность в связи с тем, что при этом происходит формирование аутоиммунных реакций. Целью работы явилось исследование клеточного звена иммунитета у неадаптированных животных при комплексном воздействии на организм травмы и условий высокогорья.

Материал и методы исследования. Исследования в условиях эксперимента с целью определения изменений клеточных и гуморальных составляющих иммунной системы были проведены нами на 140 белых лабораторных крысах обоего пола. Всем животным был экспериментально смоделирован закрытый флексионный перелом плюсневых костей стопы, и они были помещены в одинаковые ситуации как в условиях высокогорья, так и в низкогорье. Карантинный режим животных, их содержание, анестезиологические пособия и проведение операций осуществляли в соответствии с Приказом МЗ СССР от 1977 года за № 755. Все животные имели свободный доступ к питьевой воде, объем которой не ограничивался. Питание всех животных составлялось согласно Приказу МЗ СССР от 10.10.1983 года за № 1179 «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения». Выполнению экспериментальных исследований предшествовал карантинный режим, на котором находились все животные на протяжении 25-30 дней. В течение этого времени животные находились под тщательным наблюдением, и после консультации с ветеринарами и исключения патологий, для дальнейшего экспериментального исследования основная группа была вывезена на перевал Тоо-Ашуу на высоту 3200 метров над уровнем моря.

Эксперименты проводились в двух сериях опытов на животных, которые не были адаптированы к условиям высокогорья. В первой серии (контрольная) на 18 животных экспериментальное исследование нами проводилось без закрытой флексионной остеотомии плюсневых костей. Исследования во второй (основной) серии на 39 крысах мы проводили на перевале Тоо-Ашуу, после проведения закрытой флексионной остеотомии плюсневых костей. Забор крови для исследования состояния иммунной системы в условиях низкогорья (контрольная группа) проводили на следующих трех этапах: сразу после экспериментального моделирования закрытой флексионной остеотомии, на 15-е сутки после перелома и на 30-е сутки после перелома. В первой группе высокогорной серии экспериментальное моделирование флексионного перелома и первый забор крови проводили после тридцатидневной адаптации к условиям высокогорья. Второй забор крови проводили через 15 дней – 45-е сутки эксперимента. Третий забор крови был проведен на 60-е сутки, т.е. через 30 суток после перелома. Во второй группе высокогорной серии экспериментальный перелом моделировали сразу после подъема животных на перевал Тоо-Ашуу. Далее забор крови осуществляли аналогично забору крови у животных низкогорной серии.  

Методом непрямого иммунофлуоресцентного тестирования была определена фенотипическая характеристика основных субпопуляций лимфоцитов с помощью применения моноклональных антител фирмы «Сорбент» (Россия). В экспериментальном исследовании для определения концентрации Т-лимфоцитов применяли моноклональные антитела - СD-3; для определения концентрации Т-хелперов - СD-4; для определения концентрации Т-супрессоров-цитотоксических лимфоцитов - СD-8; для определения концентрации натуральных киллеров - СD-16; для определения концентрации В-лимфоцитов - СD-20. В соответствии с рекомендацией и инструкциями фирмы-производителя в объеме 0,1 мл выделенные из крови животных мононуклеары были отмечены моноклональными антителами. С помощью проточного цитофлуориметра Becton Diskinson учитывали реакции. Параллельно в процессе обработки полученных результатов данных определяли среднюю и ошибку средней. Применяя критерии Шапиро-Уилка в выборках, определяли нормальность распределения характеристик. С помощью критерия Вилкоксона, а также парных и непарных Т-критериев Стьюдента были определены статистические различия. В процессе сравнения двух выборок нулевая гипотеза отвергалась при значении критерия р≤0,05. Также при проведении статистических обработок были использованы программные обеспечения Microsoft Office Excel, версия 2007, и программа AtteStat, версия 13.11.

Результаты исследования и их обсуждение. Анализируя результаты проведенных экспериментальных исследований, установили, что у животных, как адаптированных к условиям высокогорья, так и у неадаптированных к высокогорным условиям, после смоделированного перелома плюсневых костей определены существенные изменения в системе клеточного и гуморального звена иммунитета по сравнению с животными контрольной группы. Так, концентрация Т-хелперов (СD-4+) у животных контрольной группы на первые сутки (табл. 1) составляла 27,6±07%, в то время как у неадаптированных к условиям высокогорья животных в первые сутки после перелома отмечается достоверное снижение до 23,9±0,9%. Следует отметить, что в контрольной группе (животные, которым не моделировали перелом плюсневых костей) концентрация СD-4+ на последующих этапах эксперимента, т.е. на 15-е и 30-е сутки, остается сниженной и составляет соответственно 21,3±0,33% и 21±0,3%. У неадаптированных животных основной группы на 15-е сутки эксперимента концентрация СD-4+ остается достоверно неизменной и только на 30-е сутки его концентрация возрастает до 28,8±0,9%. Данное снижение концентрации СD-4+ клеток на всем протяжении эксперимента у животных контрольной группы прежде всего связано с воздействием стрессовых факторов на организм, при которых повышается содержание глюкокортикоидов, вызывающих апоптоз лимфоидных тканей, а дальнейший возврат показателей СD-4+ у животных основной группы к исходным данным на 30-е сутки обусловлен воздействием катехоламинов, что способствует хоумингу лимфоцитов в тканях. Следует отметить, что CD4+ лимфоциты обладают хелперно-индукторной активностью, а CD8+ лимфоциты - супрессорно-цитотоксической активностью.

Таблица 1

Концентрация основных субпопуляций лимфоцитов в крови у неадаптированных к условиям высокогорья животных на разных этапах эксперимента (контрольная группа)

Примечание: * показатели статистически значимые (р<0,05) отличаются от значений предыдущего срока.

Таблица 2

Концентрация основных субпопуляций лимфоцитов в крови у неадаптированных к условиям высокогорья животных на разных этапах эксперимента (основная группа)

Примечание: * показатели статистически значимые (р<0,05) отличаются от значений предыдущего срока.

Концентрация общих Т-лимфоцитов (СD-3+) положительных клеток у животных основной группы на всем протяжении эксперимента остается достоверно повышенной по сравнению с животными контрольной группы (табл. 2). Так, на начало эксперимента показатели СD-3+ клеток составляли в контрольной группе 32,5±0,4%, в то время как в основной группе его значение равнялось 37,4±0,5%. Середина эксперимента характеризуется достоверным увеличением показателей как в контрольной, так и в основной группах. Однако к концу эксперимента у животных контрольной группы наблюдается постепенное возвращение к исходным данным (31±0,5*), в то время как у животных основной группы концентрация СD-3+ клеток повышалась достоверно и была равна 42,6±0,4%.   Выявленное повышение уровня в крови концентрации СD-3 клеток обусловлено тем, что стрессирующие факторы, травматическое повреждение как острый стресс-фактор в сочетании с факторами высокогорья активизируют иммунную систему. Это в свою очередь формирует селективную иммунную гипермобильность.

При исследовании концентрации СD-8 лимфоцитов отмечалось постепенное повышение показателей на всех этапах как в контрольной, так и в основной группе. Причем в основной группе показатели СD-8 лимфоцитов были достоверно выше уровня контрольной группы. Так, в контрольной группе на начало исследования показатель СD-8 составлял 13,3±06%, на 15-е сутки - 15,5±0,2*%, а к концу исследования, т.е. на 30-е сутки, его концентрация достоверно повысилась до 16,5±0,9*%. Что касается показателей СD-8 в основной группе, то после перелома его показатель равнялся 15,4±0,46%, на 15-е сутки его концентрация достоверно повысилась до 17,3±0,45%, а на 30-е сутки его значение равнялось 20±0,5*%. Это означало, что к концу исследования показатель СD-8 клеток был на 24% больше исходных показателей и на 21% больше данных аналогичного периода контрольной группы.   Установлено, что клетки, зараженные вирусом или адсорбирующие на своей поверхности бактериальные клетки, однозначно служат прицельными мишенями для СD-8 клеток. Повышение содержания СД-8 в крови является доказательством стимуляции функциональных возможностей цитотоксических лимфоцитов к ингибированию провоспалительных факторов в местах повреждения.

Концентрация в крови В-лимфоцитов (СD19+) как в контрольной, так и в основной группе не имела однонаправленный характер и имела волнообразное течение. В основной группе отмечалось снижение показателей на 15-е сутки до 23,4±0,88% (исходный уровень 26,7±0,4%) и резкое его повышение до 28,6±0,63% к концу эксперимента.   В контрольной группе также отмечалось волнообразное течение. Так, в начале эксперимента показатель равнялся 23,6±0,33%, к середине опытов отмечается повышение значений до 24±0,25%, и к концу исследования отмечается возврат показателей к исходным данным (22,75±1%). Несмотря на волнообразное изменение показателей СD19+ клеток, в основной группе его показатели достоверно выше на всех этапах эксперимента по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы, что свидетельствует об активирующем воздействии на иммунную систему факторов высокогорья и травмы.

Концентрация в крови естественных киллерных клеток СD-16+ лимфоцитов у животных контрольной группы резко повысилась на 15-е сутки до 16,2±0,6%. К концу исследования отмечается незначительное снижение данных до 14,5±0,4%, однако этот показатель достоверно выше исходного на 2% (12,8±1,2).   В основной группе значения показателей СD16+ клеток на этапах эксперимента отличались незначительно. После остеотомии значение этих клеток равнялось 15,7±0,2% и повысилось на 15-е сутки до 17±0,7%, а на 30-е сутки отмечается незначительное снижение показателей до 16,6±0,66%. Если учесть, что СD16+ лимфоциты являются ответственными за естественную резистентность организма, то в условиях высокогорья на фоне травмы активация клеточного компонента иммунной системы имеет разнонаправленное течение.

В сравнительном аспекте полученные нами данные в некоторых моментах имеют довольно резкие противоречия, а в других случаях находят подтверждения. Так, Ежов Ю.И., изучая изменения в иммунной системе при различных видах патологий опорно-двигательного аппарата, определил напряженность функционирования гуморального компонента и депрессию клеточного звена иммунитета [9]. Другая группа исследователей во главе с Луневой С.И., исследуя изменения в иммунной системе, определили, что наблюдается депрессия пролиферативной активности лимфоцитов, с параллельным увеличением концентрации анти- и провоспалительных факторов [10]. Однако во всех случаях авторы определяют, что при повреждениях и патологиях опорно-двигательной системы в процесс вовлекаются все основные компоненты иммунитета. Это явилось основанием для проведения мониторинга функционального состояния иммунной системы, от деятельности которой зависит течение заболевания, эффективность и результаты   лечебных процедур [11].

Таким образом, комбинированное воздействие на организм высокогорных факторов и травматического повреждения непосредственно влияет на клеточный компонент иммунной системы. При этом определяется волнообразное изменение показателей с увеличением или снижением содержания тех или иных субпопуляций лимфоцитов. Изменения данных показателей доказывают разнонаправленное стимулирующее или ингибирующее влияние вышеуказанных факторов на компоненты иммунной системы. Установленные в процессе экспериментального исследования различия в содержании основных субпопуляций лимфоцитов доказывают неодинаковое их участие в процессах регенерации костной ткани в условиях высокогорья на разных этапах эксперимента. Так, практически все показатели основной группы достоверно выше, чем показатели контрольной группы. Причем на этапах эксперимента показатели (CD3+), (CD4+) и (CD8+) постепенно повышаются к концу исследования, а концентрации (CD16+) и (CD19+) имеют волнообразный характер.

Выводы

1. У неадаптированных к условиям высокогорья животных при травмах концентрация основных субпопуляций лимфоцитов имеет разнонаправленный характер. Это обусловлено тем, что как в контрольной, так и основной группах экспериментальных животных их показатели на всех этапах исследования не имеют определенной закономерности. Незначительное повышение на всех этапах эксперимента в обеих группах наблюдается в динамике показателей CD8. Такая тенденция к повышению определяется также в динамике CD3, однако эти изменения не наблюдаются у животных основной группы.
2. У животных контрольной группы к концу эксперимента показатели основных субпопуляций лимфоцитов возвращаются к исходным значениям, в то время как у животных основной группы к концу исследования эти данные остаются достоверно повышенными. Это свидетельствует о том, что в период кратковременной 30-дневной адаптации животных к условиям высокогорья у животных отмечается включение компенсаторно-приспособительных реакций. Это определяет нормализацию показателей основных субпопуляций лимфоцитов.