Известно, что при иммунизации животных стероидными гормонами образуются специфические антитела, которые повышают содержания этих гормонов и модулируют их биологических воздействие. [1]. Так, у крыс, иммунизированных эстрадиолом (Es), возрастал титр специфических антител и увеличивалось время появления имплантированной эстроген-зависимой опухоли молочной железы [2]. Участие стероид-специфических антител в возникновении и развитии гормонозависимых заболеваний у человека ранее не изучалось. Наши предварительные исследования на небольшой выборке позволили предполагать, что антитела класса А к эстрадиолу и прогестерону (IgA-Es и IgA-Pg) могут влиять на содержание этих гормонов в сыворотке крови женщин в постменопаузе [3]. Вместе с тем уровни IgA-Es и IgA-Pg коррелировали с уровнями антител, специфичных к химическому канцерогену окружающей среды бензо[а]пирену (IgA-Bp) [4]. Частота обнаружения различных сочетаний высоких и низких уровней IgA-Es и IgA-Pg, IgA-Pg и IgA-Bp значительно отличалась у больных раком молочной железы или раком легкого от таковой у здоровых женщин [5]. Роль IgA-Bp в иммунорегуляции стероидных гормонов специфическими антителами до сих пор остается мало изученной.
Цель исследования - выявить предполагаемое участие IgA-Bp в иммунорегуляции содержания Es и Pg в сыворотке крови здоровых женщин соответствующими антителами против стероидных гормонов.
Материал и методы исследования. Материалом для исследования послужила сыворотка крови 190 некурящих женщин в постменопаузе в возрасте 50-76 лет. Средний возраст женщин – 57,7±5,1 года. Забор крови проводился на базе «Кемеровского областного центра крови» в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации 2013 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации» (Приказ Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003 г.). Все женщины, участвовавшие в исследовании, дали свое добровольное информированное согласие.
Содержание IgА-Bp, IgА-Es, IgА-Pg в сыворотке крови определяли методом неконкурентного иммуноферментного анализа, подробная методика описана в работе [5]. Антигенами послужили конъюгаты Bp, Es и Pg с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Для детекции связавшихся антител использовали меченные пероксидазой хрена козьи антитела против IgА человека (Novex, США). Уровни специфических антител вычисляли по формуле:
,
где: X – Bp, Es, Pg; ODX-BSA – связывание антител с конъюгатом гаптен-BSA, ODBSA –фоновое связывание с BSA.
Содержание Es и Pg в сыворотке крови женщин определяли с помощью конкурентного иммуноферментного анализа на наборах «ИммуноФА-Эстрадиол» и «ИммуноФА-ПГ» («Иммунотех», Россия).
Статистический анализ данных проводили с помощью пакета статистических программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., USA). Нормальность распределения количественных показателей определяли с помощью W-критерия Шапиро-Уилка (Shapiro–Wilk test). Для оценки различий между группами, имеющими ненормальное распределение показателей, использовали U-критерий Манна-Уитни (Mann–Whitney test). Критический уровень статистической значимости принимался р<0,05. Количественные показатели представлены в виде медианы (Ме) с интерквартильным интервалом (IQR).
Результаты исследования и их обсуждение. Сначала рассчитали медианы (Ме) уровней исследуемых антител, которые составили: для IgA-Es=3,2; IgA-Pg=2,1 и IgA-Bp=3,0. Затем сопоставили концентрации Es и Pg, а также их индивидуальные соотношения (Pg/Es) при низких (≤Ме) и высоких (>Ме) уровнях исследуемых антител. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Концентрация эстрадиола и прогестерона (нмоль/л) и значение их соотношения (прогестерон/эстрадиол) в сыворотке крови женщин при низких (≤Me) и высоких (>Me) уровнях исследуемых антител
|
Антитела |
Эстрадиол, Me (IQR) |
Прогестерон, Me (IQR) |
Соотношение прогестерон/эстрадиол, Me (IQR) |
|
1.1 IgA-Es≤3,2 1.2 IgA-Es>3,2 |
0,14 (0,09-0,26) 0,18 (0,11-0,31) |
0,92 (0,78-1,31) 0,85 (0,73-1,30) |
7,16 (3,27-16,34) 6,27 (3,02-10,18) |
|
p |
0,096 |
0,271 |
0,076 |
|
2.1 IgA-Pg≤2,1 2.2 IgA-Pg>2,1 |
0,18 (0,09-0,28) 0,15 (0,11-0,24) |
0,86 (0,75-1,01) 0,98 (0,76-1,55) |
4,23 (2,86-12,64) 7,42 (3,44-14,13) |
|
p |
0,778 |
0,012 |
0,127 |
|
3.1 IgA-Bp≤3,0 3.2 IgA-Bp>3,0 |
0,15 (0,10-0,26) 0,17 (0,73-1,23) |
0,94 (0,79-1,40) 0,83 (0,73-1,23) |
7,61 (3,25-15,36) 5,45 (3,02-10,62) |
|
p |
0,318 |
0,030 |
0,131 |
Не обнаружили статистически значимых различий по содержанию Es и соотношений Pg/Es в зависимости от низких и высоких значений уровней исследуемых антител. Концентрация Pg в сыворотке крови женщин оказалась значимо выше при высоких уровнях IgA-Pg по сравнению с низкими уровнями IgA-Pg (0,98 против 0,86 нмоль/л соответственно; p=0,012). При уровнях IgA-Bp>3,0 концентрация Pg была статистически значимо меньше, чем при IgA-Bp≤3,0 (0,83 против 0,94 нмоль/л соответственно; р=0,030).
В таблице 2 приведены данные по содержанию гормонов Es, Pg и их соотношения Pg/Es в зависимости от комбинации высоких и низких уровней IgA антител к этим гормонам. Концентрация Es не зависела от IgA-Es в любом сочетании с IgA-Pg. Однако при сочетании уровней IgA-Es>3,2 с уровнями IgA-Pg≤2,1 содержание Es составляло 0,25 нмоль/л, а при обратном сочетании (IgA-Es≤3,2 с IgA-Pg>2,1) оно было в 2 раза меньше (0,12 нмоль/л). И хотя эта разница была статистически недостоверна (р=0,134), нельзя исключить того, что содержание Es зависело от комбинированного воздействия этих двух антител, о чём косвенно свидетельствует анализ соотношения Pg/Es.
Таблица 2
Концентрация стероидных гормонов (нмоль/л) и значение их соотношения в сыворотке крови женщин при низких (≤Me) и высоких (>Me) уровнях антител к эстрадиолу и прогестерону в различных сочетаниях
|
Концентрация эстрадиола, Me (IQR) |
|||
|
Антитела |
IgA-Es≤3,2 |
IgA-Es>3,2 |
p |
|
IgA-Pg≤2,1 IgA-Pg>2,1 |
0,16 (0,09-0,27) 0,12 (0,09-0,16)* |
0,25 (0,09-0,48)* 0,17 (0,11-0,27) |
0,294 0,144 |
|
p |
0,122 |
0,761 |
|
|
Концентрация прогестерона, Me (IQR) |
|||
|
Антитела |
IgA-Es≤3,2 |
IgA-Es>3,2 |
p |
|
IgA-Pg≤2,1 IgA-Pg>2,1 |
0,87 (0,75-1,11) 1,42 (0,94-1,80)** |
0,81 (0,75-0,92)** 0,86 (0,73-1,51) |
0,088 0,022 |
|
p |
0,0006 |
0,088 |
|
|
Соотношение прогестерон/эстрадиол, Me (IQR) |
|||
|
Антитела |
IgA-Es≤3,2 |
IgA-Es>3,2 |
p |
|
IgA-Pg≤2,1 IgA-Pg>2,1 |
4,43 (3,02-14,53) 12,14 (8,10-17,41)*** |
3,61 (1,36-9,99)*** 6,63 (3,10-11,69) |
0,149 0,002 |
|
p |
0,005 |
0,235 |
|
Примечание: *р=0,134; **р=0,0002; ***р=0,001 – статистическая значимость между подгруппами с указанными сочетаниями низких и высоких уровней исследуемых антител.
Высокие концентрации Pg (1,42 нмоль/л) были обнаружены при комбинации высоких уровней IgA-Pg>2,1 и низких уровней IgA-Es≤3,2 (р=0,0006). Тогда как при высоких уровнях IgA-Es>3,2 содержание Pg не зависело от уровней IgA-Pg (p=0,088). Наиболее значимые различия обнаружены при сопоставлении сочетания высоких уровней IgA-Pg и низких уровней IgA-Es (1,42 нмоль/л) и обратного сочетания указанных антител (0,81 нмоль/л, p=0,0002).
Аналогичные результаты получены при анализе соотношений Pg/Es. В частности, сочетание высоких уровней IgA-Pg с низкими уровнями IgA-Es оказалось ассоциированным с максимальным значением Pg/Es=12,14, а обратное сочетание – с минимальным Pg/Es=3,61 (p=0,001). Низкие значения соотношения Pg/Es при высоких уровнях IgA-Es косвенно свидетельствуют о том, что содержание Es может быть подвержено регуляции IgA-Es и IgA-Pg при определённых условиях. Однако наибольший гормональный эффект проявляется в комбинированном воздействии IgA-Pg и IgA-Es именно на содержание Pg.
Далее исследовали влияние IgA-Bp на гормональные эффекты IgA-Es и IgA-Pg. По результатам, представленным в таблице 3, следует, что содержание Es в сыворотке крови здоровых женщин в постменопаузе не зависело от IgA-Bp ни в сочетании с IgA-Es, ни в сочетании с IgA-Pg.
Таблица 3
Концентрация эстрадиола (нмоль/л) в сыворотке крови женщин при низких (≤Me) и высоких (>Me) уровнях антител к бензо[a]пирену и стероидным гормонам в различных комбинациях
|
Антитела к гормонам |
Антитела к бензо[a]пирену |
p |
|
|
IgA-Bp≤3,0 |
IgA-Bp>3,0 |
||
|
IgA-Es≤3,2 IgA-Es>3,2 |
0,14 (0,09-0,26)* 0,15 (0,12-0,22) |
0,15 (0,07-0,26) 0,19 (0,10-0,35)* |
0,743 0,630 |
|
p |
0,544 |
0,190 |
|
|
IgA-Pg≤2,1 IgA-Pg>2,1 |
0,16 (0,09-0,28) 0,13 (0,12-0,17)** |
0,21 (0,10-0,35)** 0,17 (0,09-0,29) |
0,696 0,142 |
|
p |
0,293 |
0,884 |
|
Примечание: *p=0,132; **p=0,206 – статистическая значимость между подгруппами с указанными сочетаниями низких и высоких уровней исследуемых антител.
Концентрация Pg (табл. 4) не зависела от комбинированного воздействия IgA-Bp и IgA-Es. В то же время уровни IgA-Bp>3,0 были ассоциированы с содержанием Pg как при низких (≤2,1), так и при высоких (>2,1) уровнях IgA-Pg (p=0,014 и p=0,003 соответственно). Гормональный эффект IgA-Pg проявлялся только при низких уровнях IgA-Bp≤3,0 (0,88 против 1,51 нмоль/л, p<0,0001), но не при высоких (0,80 против 0,85 нмоль/л, p=0,066). Максимальные различия выявлены при сопоставлении высоких уровней IgA-Pg в сочетании с низкими уровнями IgA-Bp по сравнению с обратным сочетанием (1,51 против 0,80 нмоль/л, p<0,0001).
Таблица 4
Концентрация прогестерона (нмоль/л) в сыворотке крови женщин при низких (≤Me) и высоких (>Me) уровнях антител к бензо[a]пирену и стероидным гормонам в различных комбинациях
|
Антитела к гормонам |
Антитела к бензо[a]пирену |
p |
|
|
IgA-Bp≤3,0 |
IgA-Bp>3,0 |
||
|
IgA-Es≤3,2 IgA-Es>3,2 |
0,92 (0,80-1,35) 1,05 (0,76-1,55)* |
0,86 (0,76-1,10)* 0,81 (0,73-1,25) |
0,340 0,112 |
|
p |
0,451 |
0,630 |
|
|
IgA-Pg≤2,1 IgA-Pg>2,1 |
0,88 (0,76-1,11) 1,51 (1,09-1,76)** |
0,80 (0,73-0,87)** 0,85 (0,73-1,37) |
0,014 0,003 |
|
p |
<0,0001 |
0,066 |
|
Примечание: *p= 0,269; **p<0,0001 – статистическая значимость между подгруппами с указанными сочетаниями низких и высоких уровней исследуемых антител.
Аналогичные результаты получены при анализе соотношений Pg/Es (табл. 5). Сочетания IgA-Bp и IgA-Es не были ассоциированы с Pg/Es. В то же время максимальные значения Pg/Es (10,79) имели место при высоких уровнях IgA-Pg в сочетании с низкими уровнями IgA-Bp, а минимальные (3,48) – при обратном соотношении (p=0,003).
Таблица 5
Соотношения прогестерон/эстрадиол в сыворотке крови женщин при низких (≤Me) и высоких (>Me) уровнях антител к бензо[a]пирену и стероидным гормонам в различных комбинациях
|
Антитела к гормонам |
Антитела к бензо[a]пирену |
p |
|
|
IgA-Bp≤3,0 |
IgA-Bp>3,0 |
||
|
IgA-Es≤3,2 IgA-Es>3,2 |
7,28 (3,09-16,55)* 7,70 (3,84-11,69) |
6,56 (3,32-16,13) 4,57 (2,55-9,99)* |
0,931 0,280 |
|
p |
0,713 |
0,179 |
|
|
IgA-Pg≤2,1 IgA-Pg>2,1 |
4,74 (2,87-14,53) 10,79 (7,56-16,02)** |
3,48 (2,19-9,99)** 6,59 (3,07-12,93) |
0,307 0,007 |
|
p |
0,012 |
0,329 |
|
Примечание: *p=0,067; **p=0,003 – статистическая значимость между подгруппами с указанными сочетаниями низких и высоких уровней исследуемых антител.
Таким образом, IgA-Bp не влиял на гормональные эффекты IgA-Es, но значительно угнетал воздействие IgA-Pg на содержания Pg, что проявлялось и в снижении соотношений Pg/Es. Целесообразность комплексного исследования эндокринных эффектов антител против химических канцерогенов окружающей среды, с одной стороны, и антител к эндогенным стероидным гормонам - с другой, обусловлена следующим. Генотоксические эффекты химических канцерогенов (в частности, Bp) и эндогенных стероидов (в частности, Es) в патогенезе злокачественных опухолей проявляются сильнее при совместном воздействии [6; 7]. Образование аддуктов Bp и Es с макромолекулярными носителями [8-10] служит индуктором синтеза специфических антител у женщин в естественных условиях. Отдельные стероидные гормоны могут проявлять разнонаправленные действия, например Pg ингибирует эстроген-обусловленный рост эксплантов рака молочной железы [11]. Сочетанное превалирование уровней антител к Bp и Es над уровнем антител к Pg ассоциировано с риском возникновения рака молочной железы и рака лёгких у женщин, и рака лёгких у мужчин [7].
Анализ полученных результатов показал, что у женщин в постменопаузе, когда содержание половых стероидов не подвержено циклическим изменениям, высокое содержание Pg в сыворотке крови взаимосвязано с высокими уровнями IgA-Pg только при низких уровнях IgA-Bp и IgA-Es. При высоких уровнях IgA-Bp и IgA-Es влияние IgA-Pg на содержание Pg нивелируется. Аналогичные взаимосвязи обнаружены и в отношении индивидуальных соотношений Pg/Es. Это позволяет предположить, что и содержание Es может зависеть от комплексного воздействия IgA-Es, IgA-Pg и IgA-Bp, хотя прямых доказательств выявить не удалось. Если Pg и в самом деле тормозит Es-обусловленную пролиферацию клеток, а IgA-Pg способствуют повышению уровня Pg в сыворотке, становится понятной ассоциация высоких уровней IgA-Pg при одновременно низких уровнях IgA-Es и IgA-Bp с низким риском рака молочной железы и рака лёгкого. И наоборот, если уровни IgA-Es и IgA-Bp превышают уровни IgA-Pg, содержание Pg в сыворотке крови снижается, и такой иммунологический фенотип ассоциирован с высоким онкологическим риском.
Заключение. Полученные результаты представляются перспективными в развитии нового направления иммунологии химического канцерогенеза у человека. Прежде всего предстоит: выявить роль антиидиотипических антител к Bp, Es и Pg в иммуно-гормональных взаимодействиях при различных онкологических заболеваниях; исследовать генетические основы формирования индивидуальных иммунологических фенотипов (ассоциации с генетическим полиморфизмом ферментов биотрансформации и цитокинов) и их участия в нарушениях гормонального баланса у больных раком. Очевидно, что результативность этих исследований можно повысить с помощью количественных методов иммуноанализа антител, используя в качестве стандартов человеческие рекомбинантные идиотипические и антиидиотипические антитела к Bp, Es и Pg.
Работа выполнена по проекту VI.59.1.1. «Программы фундаментальных научных исследований СО РАН» (гос. задание № 0352-2019-0011).