Рак шейки матки (РШМ) является третьим наиболее распространенным злокачественным новообразованием среди женщин во всем мире [1]. Известно, что воспаление и глубокие диспластические изменения цервикального эпителия служат необходимыми этапами для возникновения, развития, прогрессирования, инвазии и метастазирования опухоли. Прогностическое значение некоторых маркеров воспаления уже установлено для многих видов рака [2]. В последнее время актуальность приобретают исследования по изучению гематологических воспалительных маркеров, отражающих течение опухолевого процесса.
Цель исследования: изучить закономерности изменений некоторых сосудисто-воспалительных белков в крови больных на разных этапах цервикального канцерогенеза.
Материалы и методы исследования
Проведено проспективное поперечное контролируемое исследование, объектом которого являлись пациентки с РШМ I–IV стадий. Средний возраст – 39±9,8 года. Материалом для исследования служила сыворотка крови. Все обследуемые были информированы о проводимой работе и дали свое письменное согласие на участие в ней. Исследование проведено с соблюдением принципов Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (WMA Declaration of Helsinki, 2013 ред.) c согласия Локального этического комитета Читинской государственной медицинской академии.
По результатам анализа медицинской документации выделены следующие клинические группы: НИ – неинвазивный РШМ (рак in situ) (n=8), ИЛ – инвазивный локализованный РШМ (n=18), МР – местнораспространенный РШМ (n=19), Г – генерализованный РШМ (n=4).
Образцы контрольной группы забраны у 15 гинекологически здоровых женщин-добровольцев, ознакомленных с дизайном исследования и давших информированное согласие на участие в нем (средний возраст – 30,0±4,4 года).
Методом проточной цитофлуометрии FC500 (Beckman Coulter, США) с использованием панели «Human Vascular Inflammation Panel 1» изучались следующие гематологические показатели: миоглобин (MG), кальпротектин (CAL), липокалин А (LCN), матриксная металлопероксидаза 2 (MMP-2), остеопонтин (OPN), миелопероксидаза (MPO), сывороточный амилоид А (SAA), белок 4, связывающий инсулиноподобный фактор роста (IGFBP-4), молекула межклеточной адгезии 1 (ICAM-1), сосудистая молекула клеточной адгезии (VCAM-1), матриксная металлопероксидаза 9 (MMP-9), Цистатин С (СС). Содержание воспалительных белков приведено как Ме [25-й; 75-й перцентили] в нг/мл.
Статистический анализ данных проводился с использованием непараметрической статистики с применением U-критерия Манна–Уитни (компьютерная программа «BIOSTAT»). Полученные результаты представлены как медиана с указанием 25-го и 75-го перцентилей. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Статистически значимые результаты исследования приведены в таблице.
Уровень некоторых сосудисто-воспалительных факторов в сыворотке крови у больных РШМ в зависимости от распространения опухолевого, нг/мл
|
Группа
Показатель |
Контроль |
НИ РШМ (n=8) |
ИЛ РШМ (n=18) |
МР РШМ (n=19) |
Г РШМ (n=4) |
|
MMP-2 |
19,71 [13,15;28,31] |
13,09 [10,09; 33,89] |
13,49 [11,25; 24,09] |
14,54^ 10,89; 18,62 |
5,82* [4,34; 7,3] |
|
OPN |
16,88 [12,37; 28,67] |
19,47 [14,74; 25,22] |
16,47 [11,84; 29,33] |
24,03 [11,72; 40,82] |
56,05* [6,95; 95,15] |
|
MPO |
485,89 [370,78; 719,71] |
440,08 [348,18; 553,08] |
571,22 [428,53; 738,80] |
387,02 [314,21; 684,85] |
265,15* [19,48; 510,81] |
|
SAA |
98,74 [73,39; 185,50] |
100,64 [47,26; 202,12] |
155,93 [67,38; 292,66] |
382,75*^ [154,10; 543,52] |
45,98* [1,58; 90,38] |
|
IGFBP-4 |
101,48 [59,13;162,63] |
116,88 [57,70; 188,12] |
95,84 [54,09; 172,68] |
91,52^ [57,19; 121,68] |
47,35* [20,64; 74.05] |
|
ICAM-1 |
4,55 2,75; 18,40 |
6,69 [3,68; 16,99] |
4,84## [3,32; 8,55] |
2,75 [1,71; 7,22] |
3,12 [1,03; 5,21] |
|
VCAM-1 |
108,31 [61,81; 168,20] |
72,63 [60,84; 82,60] |
74,93## [65,01; 119,39] |
56,54* [44,55; 98,12] |
62,62 [1,46; 123,78] |
|
MMP-9 |
253,87 [188,26; 346,07] |
181,99# [136,86; 283,62] |
306,23 [181,40; 418,71] |
548,41 [150,10; 419,08] |
140,3 [3,49; 277,11] |
Примечание. Жирным выделены статистически значимые различия:
*статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05)
# статистически значимые различия между подгруппами НИ и ИЛ (р<0,05)
## статистически значимые различия между подгруппами ИЛ и МР (р<0,05)
^ статистически значимые различия между подгруппами МР и Г (р<0,05)
При анализе полученных данных в зависимости от распространения опухолевого процесса не было выявлено достоверных различий по уровням MG, CAL, LCN2, ММР-9, CC по сравнению с величиной контроля (p>0,05).
Установлено, что по мере увеличения стадии РШМ уровень ММР-2 в сыворотке крови снижался, однако эта тенденция статистически не была достоверной. В крови больных с генерализованным РШМ концентрация ММР-2 была минимальной и составила 5,82 [4,34; 7,30] нг/мл, что на 70,5% меньше, чем величина контроля (р≤0,05), и на 60%, меньше, чем при МР РШМ (р<0,05).
Противоположную направленность носило изменение уровня OPN, величина которого у больных РШМ IV стадии была максимальна и составила 56,05 [16,95; 95,15] нг/мл, что больше соответствующей контрольной величины в 3,3 раза (р≤0,05).
Следует отметить модификацию величины МPО в сыворотке крови только у больных с Г РШМ: уменьшение уровня МПО на 45,2% по сравнению с показателем у здоровых лиц (р≤0,05).
У больных с МР РШМ уровень SAA был максимальным и составил 382,75 [154,10; 543,52] нг/мл, что превышало соответствующую величину в группе контроля в 3,8 раза (р≤0,05). По мере прогрессирования заболевания концентрация SAA резко снизилась до 45,98 нг/мл [1,58; 90,38] (р≤0,05).
Величина IGFBP-4 имела тенденцию к снижению при увеличении стадии опухолевого процесса, достигая минимального значения при метастатическом раке (р≤0,05). При сравнении межгрупповых показателей установлено, что уровень IGFBP-4 в сыворотке крови у больных с МР РШМ выше на 48,2% по сравнению с соответствующей величиной при IV стадии (р<0,05).
Достоверных различий по уровню IСAM-1 среди исследуемых подгрупп и группы контроля не выявлено. Однако в группе больных с ИЛ РШМ величина IСAM-1 была выше на 43% по сравнению с аналогичным показателем при МР РШМ.
Достоверные отличия по уровню VCAM-1 были выявлены у больных с МР РШМ: величина VCAM-1 уменьшилась на 47,82% по сравнению с контролем (р≤0,05), при этом установлено значимое отличие по этому показателю среди больных ИЛ и МР РШМ (р<0,05).
Выявлены межгрупповые отличия по содержанию ММР-9 среди подгрупп неинвазивный и инвазивный локализованный РШМ (р< 0,05).
В данной работе мы изучили уровень некоторых сосудисто-воспалительных белков у больных РШМ.
MG – полифункциональный белок, участвующий в транспорте кислорода и поглощении свободных радикалов. Данных по изучению сывороточного уровня MG у больных РШМ в литературе не найдено. Экспериментальная линия клеток РШМ, Hela, экспрессирует небольшое количество MG, возможно, именно поэтому мы не зарегистрировали изменение концентрации этого белка в крови у больных РШМ [3].
CAL представляет собой димерный комплекс, состоящий из белков S100A8 и S100A9, обладающих коканцерогенным действием за счет активации аутоиммунной агрессии, эндотелиальной дисфункции, провоспалительного действия. В настоящее время CAL рассматривается как прогностический фактор и индуктор метастазирования многих злокачественных опухолей [4]. Что касается изучения CAL в качества маркера системного воспаления и предиктора прогрессирования РШМ, данные литературы весьма противоречивы и касаются лишь регистрации внутриклеточного пула CAL в процессе малигнизации цервикального эпителия. Так, экспрессия белка S100A9 в большой степени присуща диспластическим клеткам цервикального эпителия. При этом согласно данным мультивариантного анализа экспрессия S100A9 обратно взаимосвязана со статусом лимфатических узлов и стадией РШМ, что соотносится главным образом с влиянием на ММР-9 и активацию PI3K/Akt сигнального пути [5]. Противоположные результаты сообщили X. Zhu et al [6]. Напомним, что в нашем исследовании мы не зарегистрировали достоверных различий по уровню CAL между клиническими группами и контролем. Возможно, следующий этап исследований по изучению этого показателя на локальном уровне поможет определить его роль в канцерогенезе РШМ.
LCN являются белками, секретируемыми различными клетками (макрофагами, нейтрофилами, эпителиальными клетками), в том числе опухолевыми. Они регулируют клеточный метаболизм, иммунный ответ, синтез простагландинов, секрецию маркеров воспаления, а в процессе канцерогенеза потенцируют клеточную пролиферацию и метастазирование. Сывороточный уровень LCN значимо выше у ВПЧ-позитивных женщин, однако этот показатель обладает низкой чувствительностью и специфичностью для прогнозирования ее исхода [7]. Установлено, что у больных IV стадией РШМ независимо от ВПЧ-статуса содержание LCN значимо выше [8]. Кроме того, опубликованы данные о корреляции внутриклеточного уровня LCN с метастатическим поражением лимфоузлов при РШМ, что связано с активацией ряда белков: Snail, Twist, N-кадгерина, фибронектина и MMP-9, потенцирующих эпителиально-мезенхимальный переход, провоцирующих инвазию и прогрессирование РШМ [8]. Полученные нами данные о сывороточном уровне LCN в процессе канцерогенеза РШМ носили разнонаправленный характер.
ММР – семейство цинк- и кальций-зависимых протеолитических ферментов, фактически не экспрессируемых в здоровом цервикальном эпителии. Экспрессия ММР кратно увеличивается по мере нарастания степени диспластических изменений, а патофизиологическая роль заключается в деструкции внеклеточного матрикса, базальной мембраны, в усилении ангиогенеза, что в дальнейшем определяет возможность инвазии раковых клеток и метастазирования [9]. Сывороточный уровень ММР-2 и ММР-9 максимальный при местнораспространенном РШМ, что отражает инвазивную способность и злокачественность процесса [10]. При этом важно отметить, что значения ММР-2 и ММР-9 не коррелируют со стадией РШМ (на ранних стадиях уровни ММР-2 и ММР-9 соответствуют величинам у здоровых женщин), поэтому в настоящее время эти параметры не могут рассматриваться как опция онкомаркера. Полученные нами данные о снижении уровня ММР-2 и ММР-9 у больных с генерализованным и инвазивным РШМ согласуются с результатами некоторых зарубежных исследований [11]. Как известно, кроме протеаз, опухолевые клетки шейки матки экспрессируют их ингибитор – TIMP (tissue inhibitor of metalloproteinase). Установлено, что в 88% образцы РШМ экспрессируют TIMP, что наиболее характерно для опухолей на поздних стадиях [11]. Таким образом, низкие уровни ММР-2, ММР-9 в крови у больных РШМ могут отражать агрессивность течения заболевания.
OPN является одним из матриксно-клеточных белков и выполняет функции по ремоделированию внеклеточной среды: регуляцию процессов адгезии, миграции, дифференцировки клеток. Полученные нами результаты по детекции высокого содержания OPN в сыворотке крови у больных с метастатическим РШМ согласуются с результатами других работ [12]. Следует подчеркнуть, что высокий уровень OPN коррелирует с факторами прогрессирования РШМ: размер опухоли более 4 см, стадия опухолевого процесса, низкая степень дифференцировки также рассматриваются как неблагоприятные прогностические факторы [13].
МПО находится в азурофильных гранулах нейтрофилов и выбрасывается во внеклеточное пространство во время активации последних с целью инициации каскада иммунологических реакций, направленных на уничтожение патогена. Кроме этого, повышенный уровень МПО в крови рассматривается как маркер воспалительного и окислительного стресса, провоцирующий хроническое воспаление и развитие онкопатологии. Известны генетические полиморфизмы МПО, повышающие риск возникновения РШМ [14]. Полученные нами данные о снижении величины МПО в крови у больных с генерализованным РШМ находят свое отражение в других исследованиях [14]. Патофизиологическое понимание выявленных изменений можно объяснить нарушениями кислородзависимой и кислороднезависимой цитолитической активности нейтрофильных гранулоцитов у онкологических больных на фоне изменения мобилизационной активности клеток, что можно интерпретировать как глубокое повреждение реализации и резервирования ферментных и неферментных возможностей нейтрофилов, необходимых для осуществления микробицидных, цитотоксических и цитолитических свойств для блокирования опухолевой прогрессии [15].
SAA – белок острой фазы воспаления, синтезируемый главным образом в печени в ответ на провоспалительные цитокины, а также во внепеченочных тканях, включая линии клеток первичного и метастатического рака. С позиции канцерогенеза SAA рассматривается как связующее звено между механизмами хронического воспаления и малигнизацией, в том числе за счет усиления деградации внеклеточного матрикса путем активации ММР, модуляции адгезии опухолевых клеток, увеличения клеточной миграции, индукции выброса цитокинов и хемокинов, стимуляции ангиогенеза, а также активации сигнальных путей ERK1/2, p38 и JNK [16]. Согласно данным метаанализа высокий уровень SAA является неблагоприятным фактором общей и безрецидивной выживаемости у больных с солидными опухолями [16]. Полученные нами данные о повышенном уровне SAA в крови у больных с местнораспространенным РШМ согласуются с результатами других исследований, указывающих на имеющиеся изменения как на системном, так и на и на локальном уровнях, что отражает напряженность воспалительных каскадов в процессе канцерогенеза [17].
IGFBP представляют собой семейство белков, связывающих инсулиноподобные факторы роста (IGF), запускающих сигнальные митотические пути клетки, регулирующих пролиферацию и дифференцировку, метаболизм, продолжительность жизни клетки. Известно, что гиперэкспрессия и высокое содержание в сыворотке крови IGFBP-4 присущи некоторым видам неоплазий (таким как рак легкого, молочной железы, яичников и др.), терапевтическое блокирование IGFBP-4 рассматривается как потенциальная мишень для таргетной терапии [18]. Полученные нами данные о крайне низком уровне IGFBP-4 в крови больных генерализованным РШМ могут также указывать на невозможность активации альтернативных, не связанных с IFG путей антиканцерогенного действия, заблокированных во время прогрессирования опухолевого процесса. Наше предположение находит свое подтверждение в литературных источниках, указавших роль IGFBP-4 при раке печени [19].
ICAM-1 и VCAM-1 представляют собой гликопротеины, необходимые для клеточной и межклеточной адгезии опухолевых клеток. Эндотелиальная анергия – низкая экспрессия молекул клеточной адгезии эндотелиальными клетками, рассматриваемая как один из механизмов предотвращения лейкоцитарной инфильтрации опухоли и прогрессирования [20]. Таким образом, полученные нами данные о низком уровне VCAM-1 и ICAM-1 при МР РШМ являются отражением прогрессирования опухоли.
СС относится к семейству ингибиторов цистеиновых протеиназ и рассматривается как эндогенный маркер скорости клубочковой фильтрации и ренальной дисфункции. Цистеиновые протеиназы вызывают разрушение внутриклеточных белков и структур внеклеточного матрикса, активируют некоторые ММР, участвуют в регуляции пролиферации, апоптоза, тем самым способствуют диссеминации опухоли [21]. Однако данные по изучению уровня СС как маркера опухолевой диссеминации и прогрессирования при онкологических заболеваниях весьма противоречивы. Колебания уровня СС в сыворотке крови у онкологических больных могут отражать не только инвазивность опухоли, но и ренальную дисфункцию. В нашем исследовании мы не получили достоверных различий по величине СС в крови у больных разных клинических групп, что не дает возможности говорить о его значимости в качестве биомаркера РШМ.
Заключение
В настоящее время складывается понимание того, что рак не является локальным процессом, а относится к числу хронических заболеваний, сопровождающихся изменениями и на системном уровне. Полученные нами данные позволяют расширить имеющиеся сведения о системных воспалительных изменениях в крови у больных РШМ, служащих отражением локального воспалительного напряжения, и в дальнейшем могут быть использованы для разработки дополнительных критериев дифференциальной диагностики распространенных форм РШМ, а также методов системного персонализированного лечения.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых МК-6143.2018.7 (соглашение № 075-02-2018-547).