В настоящее время острый панкреатит (ОП) остается одним из проблемных вопросов среди абдоминальных патологий неотложной хирургии. Это обусловлено: деструктивным характером патологии у четверти пациентов с острым панкреатитом; высокой летальностью, которая составляет от 15 до 40% при легкой тяжести (стерильный панкреонекроз) и до 75% при тяжелой форме (инфицированный панкреонекроз); несвоевременной оценкой степени тяжести, диагностикой и поздним оказанием патогенетического лечения [1].
Согласно концепции ферментативной теории, развитие острого панкреатита начинается с активации энзимов поджелудочной железы по иным или другим причинам, с последующим повреждением своих тканей и их поступлением в кровообращение [2].
Формирование эндогенной ферментативной интоксикации запускает активацию системного воспалительного ответа, что приводит к прогрессированию заболевания и развитию грозных осложнений [3].
Для поддержания гомеостатического состояния внутренней среды требуется иммунный ответ, который заключается в возбуждении защитных реакций организма, усилении механизмов распознавания токсико-действующих веществ, обезвреживании, поглощении и удалении антигенных детерминант [4].
Изменения в системе иммунитета, находясь в обратной зависимости от глубины и распространении патоморфологических изменений в панкреасе, совместно обременяют друг друга и срывают механизм межсистемной регуляции [5]. Полиморфонуклеары, являющиеся классическими фагоцитами, обладают подвижностью, адгезивностью, высвобождением биологически активных веществ и сильного антибактериального агента (миелопероксидаза), способностью к хемотаксису и фагоцитозу и др. [6].
В клинической практике используются оценочные иммунный статус-тесты, основанные на химических свойствах азогидразонов (анализ восстановления нитросинего тетразолия (НТС)) – соединения (R1N=N-CR2=N-NHR3) – в образовании тетразолиевых свободных радикалов, и содержаниях лизосомально-катионных белков (ЛКБ) [7].
Отмечено, что результат НСТ-теста позволяет оценить функциональные резервы фагоцитов в результате активации метаболической, пероксидазных и кислородозависимых систем биоцидности. С другой стороны, ЛКБ-тест определяет неэнзимные катионные протеины, признанные самыми агрессивными и многофункциональными по механизму бактерицидного эффекта, и отражает кислородонезависимые реакции биоцидности [8].
Цель исследования: изучить функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов в условиях острого панкреатита различной тяжести.
Материалы и методы исследования
В основу работы входили результаты клинико-лабораторных и инструментальных исследований 51 пациента с острым панкреатитом, рандомизированных по полу, возрасту, давности патологии, этиологии возникновения, степени тяжести, клиническо-лабораторно-инструментальным данным, биохимическим анализам активности нейтрофильных лейкоцитов и разделенных на две группы:
первая (n=28) – в состав которой включены больные ОП легкой тяжести, и вторая группа (n=23) – с тяжелой степенью.
В то же время ряд показателей изучен у здоровых добровольцев (n=18) в возрасте от 24 до 57 лет обоего пола для сравнения с нормой.
Данная работа проведена на кафедре факультетской хирургии Медицинского института МГУ им. Н.П. Огарева, базирующейся в РКБ им. С.В. Каткова, г. Саранск.
Тяжесть пациентов оценена с помощью шкалы APACHE-II при их госпитализации в клинику. При этом отмечено, что сумма полученных баллов у больных I группы составила 3,5±0,24 балла, а у II – 11,5±0,61 баллов. Известно, что при количестве баллов шкалы более 9 определяется тяжелая форма.
Причиной развития острого панкреатита у пациентов являлось злоупотребление алкоголем и алиментарными факторами (68,6%) и желчнокаменной болезнью (31,4%).
Среди больных мужского возраста был 31 человек, женского – 20. При этом возрастная медиана составила 44 года, а интерквартильный размах 25-75% – 31-57 лет (мужчины – 41 год, ИКР – 26-57 лет, женщины – 48 лет, ИКР – 30-59 лет).
Пациентам данной работы при поступлении в хирургический стационар проведена базисная терапия, в схему которой включены: цитостатический (5-фторурацил по 10–15 мг/кг или циклофосфан по 1–1,5 мг/к), инфузионный (глюкозо-инсулиновые растворы по 800,0 мл 5% глюкозный раствор с инсулином 1 ед. на 4 г сухого вещества глюкозы, раствор Рингера или другой солевой раствор по 800,0 мл), спазмолитический (платифиллин 0,2% – 1,0, папаверин 2% - 2,0 мл, баралгин 2,0–3,0 мл, но-шпа 2% – 2,0 мл по 2–3 раза в сутки), антигистаминный (димедрол 1% - 1,0 мл), антибактериальный (цефазолин 2,0 г на 200 мл раствора хлорида натрия) компоненты.
Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) является окислительно-восстановительным индикатором. Нитросиний тетразолий, поступая в нейтрофилы, подвергается рекреации и преобразуется в нерастворимый формазан при участии кофермента никотинамидадениндинуклеотида. 0,05 мл венозной крови вносили на лунки планшета, затем добавляли раствор НСТ по 0,05 мл 0,2%. Далее смесь инкубировали в термостате при t +37,5 °C на 30 мин. Затем мазок средней толщины делали и фиксировали в растворе метанола на 5 мин. После того докрашивали раствором сафранина (0,5%) по 3–5 мин. Под микроскопом подсчитали 100 сегментоядерных нейтрофилов и определяли процент положительно реагирующих с НСТ клеток.
Содержание лизосомально-катионных белков (ЛКБ) определено с помощью красителей анионного типа (бромфенолового синего). Высушенный мазок венозной крови был фиксирован в течение 60–90 с в 5% сульфосалициловой кислоте и тщательно промыт дистиллированной водой. Этот мазок окрашивали в растворе бромфенолового синего (0,1%) в течение 1–2 мин., затем промывали в боратном буфере по 4–6 мин. и высушивали. Гранулы катионных протеинов окрашивались в синий цвет. Далее вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК) с помощью полуколичественного метода и по формуле Астальди-Верга.
Полученные цифровые результаты были обработаны с помощью метода вариационной статистики при использовании критерия t Стьюдента для определения статистической значимости средних величин как в случаях сравнения независимых выборок, так и при соотношении связанных групп. Для этого использовали Microsoft Word 2016, Microsoft Excel 2016 и программу Statistic 12.0.
Результаты исследования и их обсуждение
Острый панкреатит разного характера течения сопровождался повышенной активацией иммунного ответа с первых суток, причем прослеживалась различная динамика перераспределения пулов нейтрофильных гранулоцитов в сопряженности с тяжестью патологии и периодом принимаемого лечения согласно анализу лизисомально-катионных белков и показателям теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-теста) (рис. 1, 2 и таблица).
Динамика цитохимической активности нейтрофильных гранулоцитов при остром легком панкреатите (М±m)
|
Показатель |
Норма |
Группы исследования |
Этапы наблюдения, сут. |
||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|||
|
НСТ-тест-индуцированный, % |
42,47 ±2,67 |
I (n=28) |
51,47 ±3,99 |
55,49 ±4,25 |
59,17 ±3,71 |
61,04 ±2,97 |
48,13 ±3,46 |
|
II (n=23) |
61,33 ±4,65* |
69,52 ±5,65* |
73,76 ±5,22* |
81,11 ±5,04* |
74,24 ±5,11* |
||
|
СЦК НСТ-теста, у.е. |
0,66 ±0,04 |
I (n=28) |
1,09 ±0,11 |
1,16 ±0,04 |
1,23 ±0,08 |
1,05 ±0,08 |
0,75 ±0,02 |
|
II (n=23) |
1,48 ±0,09* |
1,62 ±0,10* |
1,58 ±0,08* |
1,75 ±0,06* |
1,43 ±0,04* |
||
|
ЛКБ-тест СЦК, у.е. |
1,53 ±0,03 |
I (n=28) |
1,94 ±0,04 |
1,81 ±0,03 |
1,76 ±0,02 |
1,69 ±0,03 |
1,62 ±0,02 |
|
II (n=23) |
2,19 ±0,06* |
2,36 ±0,08* |
2,47 ±0,06* |
2,31 ±0,03* |
1,89 ±0,06* |
||
Примечания. Жирный шрифт – достоверность данных по отношению к данным нормы при р<0,05. * – достоверность данных по отношению к данным первой группы при р<0,05.
Согласно результатам спонтанного НСТ-теста установлено, что у пациентов с острым легким панкреатитом в ранние сроки поступления в клинику и через 2, 3 и 4 суток отмечался прирост содержания лейкоцитов на 17,2, 20,6, 25,4 и 35,7% (p<0,05) соответственно. В последующие сроки содержание лейкоцитов в крови соответствовало нормальным значениям (рис. 1).
Рис. 1. Динамика спонтанного НСТ-теста при остром панкреатите
Примечания здесь и далее: * – достоверность данных по отношению к данным нормы при р<0,05;
– – достоверность данных по отношению к данным первой группы при р<0,05
Большой клинический интерес по данному же тесту вызвали результаты во второй группе пациентов, у которых был острый панкреатит тяжелой формы, где отмечалось высокое содержание сегментоядерных нейтрофилов на протяжении всего периода наблюдения по отношению к норме на 36,3–78,3% (p<0,05) и первой группе (пациенты с легкой степенью острого панкреатита) на 30,7–49,3% (p<0,05) (рис. 1).
При изучении фагоцитарной активности сегментоядерных гранулоцитов (НГ) по индуцированному НСТ-тесту при остром панкреатите как легкой тяжести, так и тяжелой нами выявлено, что эта функциональная способность была повышена: в первой группе такая реакция фиксировалась на 1-2-3-4-м этапах исследовательского периода на 21,1–39,3% (p<0,05), а к 5-м суткам стандартной терапии приближалось к нормальному ответу (таблица).
Между тем в группе с тяжелым характером заболевания иммунный процесс был активный в течение всех суток на 44,4–90,9% (p<0,05). По данным этого исследования обращаем внимание на то, что реакция иммунной защиты ассоциировалась с тяжестью патологии, так как значение НГ во 2-й группе по данному тесту превышало первую во все время наблюдения на 25,2–54,1% (p<0,005) (таблица).
Систематическое исследование цитохимических особенностей согласно показателям среднего цитохимического коэффициента (СЦК) спонтанного НСТ-теста позволило установить, что у больных острым панкреатитом первой группы он был существенно (на 72,8%) повышен при поступлении и во 2-4-й день проведения стандартного лечения – на 47,4–16,9% (p<0,05) (рис. 2).
Рис. 2. Динамика СЦК НСТс-теста при остром панкреатите
Прогрессирование течения заболевания несло свое влияние на процесс иммунного ответа в виде усиления интенсивности, поскольку цитохимическая реакция во II группе на всех сутках исследовательского периода преувеличивала нормальный уровень на 169,4–115,2% (p<0,05), а в I группе на 55,8–108,1% (p<0,05) (рис. 2).
Согласно цитохимической реакции индуцированного НСТ-теста установлено, что острый панкреатит сопровождался токсогенной зернистостью нейтрофилов, которая было сопряжена со степенью тяжести, что определяет развитие «метаболического взрыва», активацию пероксидазных систем и отражает кислородозависимые процессы биоцидности. В первой группе результат данного теста превышал нормальный уровень в первые 4 суток на 75,4–59,0% (p<0,05). При этом к последнему этапу исследования активность НГ приближалась вплотную к норме (таблица).
Во второй группе цитохимическая запись была существенно высока на всех сроках наблюдения не только к нормальному уровню – на 124,2–165,1% (p<0,05). Всё-таки значительная активация фагоцитарного процесса в данной группе подтвердилась и при сравнении с результатом первой группой, в которой содержание НСТи-теста было ниже на – 39,6–90,5% (p<0,05) (таблица).
При изучении полученных данных ЛКБ-теста отмечено, что у пациентов с легким острым панкреатитом при госпитализации содержание ЛКБ возрастало на 26,7% (p<0,001) по отношению к исходному показателю. Повышенное (на 18,3%) количество их сохранялось и в последующие сутки. Через 3 и 4 суток содержание ЛКБ падало и по сравнению с нормой понижалось на 15,0 и 10,4% (p<0,05) соответственно. В срок 5 суток их уровень приближался к норме (таблица).
При остром панкреатите тяжелой степени выявлено повышение ЛКБ-показателя на первом этапе исследования на 43,1% (p<0,05). Значения данного теста продолжались увеличиваться в последующие сутки (2, 3 и 4-е) на 54,2–61,4% (p<0,05). К концу исследовательского периода результат этого анализа снижался по отношению к норме, но оставался выше на 23,5% (p<0,05).
Выводы
Острый панкреатит уже в первые сроки после поступления пациентов в стационар сопровождается значительной активностью сегментоядерных лейкоцитов, сопряженной со степенью тяжести патологии.
При легкой форме заболевания повышение цитохимической активности нейтрофильных гранулоцитов, в основном за счет кислородозависимых процессов, наблюдается лишь на протяжении первых суток (4) периода исследования. Причем резервные возможности НГ, оцениваемые по СЦК НСТи-теста, снижаются начиная с 3-го дня болезни, а к концу нормализуются.
Наиболее резкие и значимые модификации нейтрофильных гранулоцитов наблюдаются у пациентов с острым тяжелым панкреатитом как в начальный период (1-3-е сутки), так и в конечный (4-5-е сутки). Значительный прирост показателей НСТ-теста, СЦК НСТи-теста и содержания ЛКБ в течение всего наблюдаемого срока заболевания свидетельствует о высокой активации гранулоцитарных нейтрофилов и их функциональном и метаболическом ответе респираторным взрывом на развитие острого воспаления в поджелудочной железе.