Рак шейки матки (РШМ) представляет собой угрозу как репродуктивному, так и социальному состоянию общества [1]. Учитывая имеющиеся данные о вирусной природе заболевания, а также о возможности спонтанной регрессии вируса папилломы человека (ВПЧ), актуальными являются работы по изучению вклада иммунной системы в развитие цервикального канцерогенеза. Персистенция ВПЧ-инфекции, связанная с «невосприимчивостью» иммунной системы, является главным фактором возникновения предопухолевых и злокачественных поражений шейки матки [2].
Цель исследования: изучить состояние некоторых параметров неспецифического иммунного ответа на системном уровне в процессе малигнизации цервикального эпителия.
Материалы и методы исследования
Участниками исследования были женщины (40), обследованные в Забайкальском краевом онкологическом диспансере: у 20 был выставлен диагноз цервикальная интраэпителиальная неоплазия III степени (ЦИН III степени) - I клиническая группа, 20 – с неинвазивным раком шейки матки (II клиническая группа). Средний возраст пациенток составил 38±8,26 года. Контрольная группа – здоровые женщины-добровольцы без патологии шейки матки (n=10). Стратификация на группы проводилась с учетом морфологического и цитологического (для группы контроля) подтверждения состояния цервикального эпителия. Материал исследования – сыворотка крови. Все обследуемые были информированы о проводимой работе и дали свое письменное согласие на участие в ней. Исследование проведено с соблюдением принципов Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации c согласия Локального этического комитета Читинской государственной медицинской академии [3]. Методом проточной цитометрии с использованием панели The LEGENDplexTM Human AntiVirus Response Panel исследовали следующие величины: профили цитокинов (интерлейкины (IL) 1β, 6, 8, 10, 12), интерферонов (IFN α, β, γ, λ1 и λ2/3), TNF-α, хемокина IP-10 и GM-CSF. Содержание исследуемых параметров выражалось в пг/мл. Статистический анализ результатов исследования проводился с применением критерия Манна–Уитни. Достоверность различий считалась при р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования представлены в таблице.
Активность противовирусного иммунного ответа в процессе цервикального канцерогенеза (Ме (25-й; 75-й перцентили))
|
Группа Параметры, пг/мл |
Контроль (n=10) |
I группа, предрак (n=20) |
II группа, рак (n=20) |
|
IL-1β |
17,7 [16,8; 18,6] |
32,7 [12,5; 52,9] |
19,6* [17,6; 19,6] |
|
IL-6 |
11,3 [10,2; 12,4] |
11,5* [11,4; 11,6] |
12,8*# [12,8; 13,5] |
|
TNF-α |
6,1 [6,1; 6,2;] |
79,0 [5,0; 153,1] |
5,4 [5,4; 6,8] |
|
IP-10 |
17,1 [16,8; 17,3] |
26,3* [12,5; 40,1] |
54,3*# [54,3; 56,4] |
|
IFN-λ1 (IL-29) |
8,2 [7,5; 8,9] |
20,5 [7,5; 33,5] |
10,6* [10,6; 11,6] |
|
IL-8 |
23,2 [22,0; 24,4] |
576,0* [24,8; 1127,2] |
22,1*# [20,3; 22,1] |
|
IL-12p70 |
5,3 [5,0; 5,6] |
5,3 [4,1; 6,5] |
5,4* [5,4; 6,4] |
|
IFN-α2 |
7,2 [6,6; 7,8] |
121,8 [7,0; 236,6] |
8,1* [8,1; 10,2] |
|
IFN-λ2/3 (IL-28A/B) |
7,9 [5,9; 9,8] |
5,1* [4,1; 6,1] |
6,9*# [5,8; 6,9] |
|
GM-CSF |
6,7 [6,4; 7,0] |
7,6* [6,7; 8,6] |
55,1*# [52,6; 55,1] |
|
IFN-β |
13,6 [12,4; 14,9] |
14,3* [13,8; 14,9] |
12,8*# [10,7; 12,8] |
|
IL-10 |
4,1 [4,1; 4,2] |
4,6 [3,7; 5,5] |
5,4* [5,3; 5,4] |
|
IFN-γ |
12,7 [12,2; 13,2] |
14,4 [13,0; 15,7] |
15,1* [15,1; 15,1] |
* статистически значимые отличия между соответствующей группой и контролем;
# статистически значимые отличия между I и II группами.
В сыворотке крови у больных с ЦИН III степени увеличились значения IL-6, IP-10, IL-8, IFN-λ2/3, GM-CSF и IFN-β на 1,8%, 53,8%, в 24,8 раза, на 64,6%, 13,4% и 5% по сравнению с контролем соответственно (р<0,05) .
В сыворотке крови у больных РШМ увеличились уровни GM-CSF, IL-10, IFN-γ, IL-1β, IP-10, IL-6, IFN-λ1, IL-12p70, IFN-α2 на фоне снижения содержания IL-8, IFN-λ2/3 и IFN-β р<0,05.
При сравнении показателей между клиническими группами установлено, что уровни GM-CSF, IL-6, IFN-λ2/3, IP-10 были выше у больных РШМ в 7,3 раза, на 11,3%, 35,3% и в 2 раза соответственно (р<0,05), величины IL-8 и IFN-β были в 26 раз и на 10,5% меньше (р<0,05).
Перед обсуждением полученных результатов считаем целесообразным напомнить о патофизиологической роли исследуемых цитокинов, интерферонов и хемокинов.
IL-1β является провоспалительным цитокином, главным образом, вырабатываемым моноцитами крови и тканевыми макрофагами, и участвует в опосредовании как острого, так и хронического воспаления. Известно, что полиморфизм гена IL1B связан с различными видами злокачественных опухолей, в том числе РШМ [4].
IL-6 вместе с простагландином E2 способствует образованию макрофагов M2-фенотипа, экспрессирующих иммуносупрессивный запрограммированный лиганд смерти 1 (PD-L1), что приводит к прогрессированию дисплазии шейки матки [5]. Индуцируемые IL-6 сигнальные пути, такие как JAK / STAT3 или C / EBPβ, играют важную роль для перепрограммирования микросреды стромы и модификации иммунного ответа за счет ингибирующего воздействия Th1 [5]. Кроме того, высокий уровень IL-6 является независимым фактором неблагоприятного прогноза РШМ [5].
IL-8 является также провоспалительным цитокином, поддерживает разные звенья канцерогенеза: клеточная пролиферация, адгезия, миграция, инвазия опухолевых клеток, химиорезистентность, ангиогенез – путем связывания с различными видами рецепторов, нарушая ERK и Notch сигнальные пути [6].
IL-10 является важным провоспалительным фактором. В процессе развития рака шейки матки продукция IL-10 может индуцироваться и поддерживаться различными клеточными источниками, включая инфицированные клетки плоского эпителия, дендритные клетки (DC), ассоциированные с опухолью макрофаги (TAM), T-регуляторные клетки (Treg) и опухолевые клетки. IL-10 может вызывать ингибирование продукции провоспалительных цитокинов, влиять на функцию T-лимфоцитов, дифференцировку DC [7].
IL-12 синтезируются макрофагами, фагоцитами, В-лимфоцитами, состоит из двух субъединиц, биологически активной из которых является гетеродимер 70kDa (p70). Его физиологическая роль заключается в стимуляции клеточного иммунного ответа [8].
IP-10 (IFNginducible protein) относится к классу CXCL хемокинов, участвующих в канцерогенезе меланомы, рака яичников, миеломы, В-клеточной лимфомы, рака кожи, плоскоклеточного рака органов головы и шеи [9]. Патофизиологическая роль данного соединения двойственная и зависит от состояния микросреды и клеток иммунной системы. Гиперпродукция IP-10 коррелирует с плохой выживаемостью у больных, страдающих раком поджелудочной железы [10]. Вместе с тем, по данным работы Y. Taslimi et al. (2016), IP-10 обладает противоопухолевой, антиметастатической и антиангиогеной активностью на некоторых клеточных линиях [11].
TNF-α обладает разнообразными эффектами, модулируя опухолевый процесс [12; 13]. С другой стороны, он способствует опухолевой прогрессии, иммунной агрессии в патологическом очаге. Доказано, что увеличение уровня TNF-α является неблагоприятным фактором, указывающим на прогрессирование злокачественного процесса, что коррелирует со снижением общей выживаемости [13]. Столь разнообразный механизм действия TNF-α определяется не только активностью самого белка, но и его взаимосвязью с рецепторами клетки, статус которых отражает его биологическую активность.
GM-CSF способствует выживанию, пролиферации и дифференцировке гемопоэтических клеток костного мозга [14]. В иммунном ответе GM-CSF помогает регулировать реакцию на инфекционные и воспалительные сигнальные каскады путем рекрутирования дендритных клеток и запуска их созревания, а также стимулирования путей клеточного иммунитета. Патофизиологическая роль GM-CSF определяется типом опухолевой клетки и характером микроокружения. Так, данное соединение может обладать как противоопухолевой активностью, так и стимулировать развитие неоплазии [15].
IFNs представляют собой семейство секретируемых полипептидов, которые впервые были идентифицированы по их способности вызывать клеточную устойчивость к вирусной инфекции. IFN-α, IFN-β, IFN-λ высвобождаются из многих инфицированных вирусом клеток.
IFN-λ оказывает противовирусное, антипролиферативное, противоопухолевое действие [16]. IFN-γ высвобождается из активированных Т-лимфоцитов и NK-клеток, обладает противовирусной активностью, в частности модифицирует выброс белков с противовирусными свойствами, большинство из которых предотвращают транскрипцию или трансляцию ВПЧ путем нарушения JAK2/STAT1 пути [17]. Кроме этого, в литературе появляются сведения о его проопухолевом действии, что было продемонстрировано на клеточных линиях фибросарком, гепатом, рака молочной железы, меланомы, лейкемии, что может указывать на первичную резистентность опухолевых клеток к данному интерферону и подлежит последующему изучению [18].
В настоящее время система IFN рассматривается как важнейший модулятор иммунного ответа [19].
Судьба ВПЧ-инфицированной клетки цервикального эпителия определяется не только состоянием макроорганизма, но и возможностью персистенции аффекта вследствие активации механизмов ускользания от иммунного ответа: модификации активности, функционирования иммунной системы, модуляции синтеза цитокинов и хемокинов и др. [20].
Вирусные онкопротеины Е6 и Е7 способны увеличивать экспрессию IFRD1 (Interferon-related developmental regulator 1), белка, ответственного за рекрутирование гистондеацетилаз, приводя к нарушению активации фактора NF-kB, подавляя его способность реагировать на иммунологические сигналы, тем самым нарушая продукцию разнообразных цитокинов и способствуя злокачественной трансформации цервикального эпителия [20]. Вирусные онкопротеины Е6 и Е7 нарушают экспрессию гена IL-1β, а также с помощью убиквитин-белковой лигазы разрушают его [20]. Некоторые белки ВПЧ активируют иммунный ответ. Так, E2 может модулировать экспрессию 92 генов, участвующих во врожденном иммунном ответе, включая STING (the stimulator of interferon genes, трансмембранный белок, повышающий экспрессию интерферона бетта), IFN-κ (интерферон каппа) и ISG (интерферон-стимулируемый ген) [21]. Вместе с этим вирусные онкопротеины модифицируют секрецию интерферонов, цитокинов и хемокинов путем изменения передачи сигналов к ядру клетки через нарушение фосфорилирования промежуточных белков [22]. Кроме этого, ВПЧ нарушает взаимодействие между клетками иммунной системы, вызывает репрограммирование их фенотипа, провоцируя канцерогенез [20]. В частности, известны провоспалительный фенотип М1 макрофагов и противовоспалительные фенотипы М2а, М2b, М2с.
Макрофаги М1 выделяют большое количество провоспалительных цитокинов, оксид азота, активные формы кислорода, активно участвуют совместно с Th-1 (Т-хелперы первого типа) и цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) в противоопухолевом иммунном ответе [23]. Противоопухолевые свойства макрофагов, главным образом, определяются возможностью выброса ИЛ-12, необходимого для запуска противоопухолевого иммунного ответа, опосредованного Th-1 и CTL [20]. Однако длительное повышение уровня ИЛ-12 у женщин с персистирующей ВПЧ-инфекцией подчеркивает потенциальные отрицательные биологические эффекты длительного воспаления, вызывая повреждение тканей [24].
Макрофаги М2 фенотипа, наоборот, продуцируют противовоспалительные цитокины, совместно с Th-2 регулируют воспаление, снижают активность Т-лимфоцитов, стимулируют ангиогенез, метастазирование, способствуют опухолевой прогрессии [20]. Известно, что степень инфильтрации М2-макрофагами опухолевой ткани прямо коррелирует с пролиферацией и выживанием опухолевых клеток. Установлено, что количество макрофагов, инфильтрирующих опухолевую ткань, пропорционально степени поражения цервикального эпителия [20].
A.P. Lepique et al. (2009) in vitro выяснили, что M2-макрофаги инфильтрируют ВПЧ-инфицированные клетки и вызывают подавление противоопухолевого Т-клеточного ответа, повышая продукцию ИЛ-10, тем самым способствуя росту опухоли [25]. Кроме этого, ИЛ-10 вызывает активацию Treg, оказывающих проопухолевое действие. Treg угнетают функцию CTL, способствуя персистенции ВПЧ и прогрессированию опухоли [26]. По некоторым данным, высокий уровень IL-10 можно использовать для прогнозирования персистенции ВПЧ и прогрессирования опухоли, а также в качестве потенциальной мишени для модуляции иммунного ответа [26].
Описанный в литературе «континуум» макрофагов приводит к модификации клеток микроокружения: перепрограммирование Th0 в Th1, макрофагов М2 в Th2, Т-лимфоцитов в CTL, к нетозу, что способствует невосприимчивости опухолевых клеток для иммунной системы и прогрессии заболевания. Складывается понимание, что сама ВПЧ-инфицированная клетка и ее микроокружение являются регуляторами активности и функционирования иммунной системы.
В литературе имеются данные об усиление нетоза (гибель нейтрофилов) с формированием нейтрофильных ловушек у больных цервикальным раком на фоне модификации цитокинового и хемокинового статуса как на локальном, так и системном уровнях, что в настоящее время рассматривается как одно из звеньев канцерогенеза [27].
Наряду с приобретенными модификациями в иммунной системе, описано большое количество данных о полиморфизмах генов иммунного ответа, вызывающих изменения как локального, так и системного иммунного ответа на ВПЧ-инфекцию, способствующие ее персистенции и дальнейшей малигнизации цервикального эпителия [20].
В обзоре литературы A.M. Mehta et al. (2018) приводят результаты современных научных исследований об изучении ассоциаций полиморфизмов генов, кодирующих цитокины, с риском возникновения РШМ у женщин разных этнических групп. Авторы приходят к выводу, что исследуемые полиморфизмы генов являются усугубляющими факторами, способствующими персистенции ВПЧ и прогрессированию цервикального поражения [28].
Согласно полученных нами данным, в исследуемых группах уровень IL-12 фактически достоверно не изменился, что может указывать на недостаточную активацию противоопухолевого иммунного ответа. Кроме этого, константный уровень TNF-альфа также свидетельствует об избегании противоопухолевой иммунной защиты, что согласуется с данными о состоянии локального уровня этого цитокина у больных РШМ, полученными нами ранее [29].
На этом фоне только в сыворотке крови больных, страдающих РШМ, зарегистрировано увеличения количества IL-10 на 31,7% (р<0,05), что является отражением проопухолевой активности клеток иммунной системы. Полученные данные согласуются с работами зарубежных ученых, указывающих на высокий уровень IL-10 в крови у женщин на разных этапах трансформации цервикального эпителия в результате влияния онкогенов ВПЧ на транскрипцию гена IL-10 [7].
Снижение уровня IL-8 может быть следствием влияния онкопротеинов Е6 и Е7 на транскрипционный фактор и белки, активирующие их, что также подтверждается результатами других научных работ [30].
Повышение величины GM-CSF в процессе цервикального канцерогенеза было выявлено и по результатам других научных работ [31]. В настоящее время предлагается использовать этот показатель как один из биомаркеров для дифференциальной диагностики поражений цервикального эпителия [31].
Выводы
Малигнизация цервикального эпителия сопровождается модификацией иммунного профиля сыворотки крови. Изменения иммунологического статуса у больных с цервикальными поражениями подчеркивает сложность иммунных реакций как важного компонента противоопухолевой защиты на системном уровне.