Дисметаболические нарушения в сочетании с окислительным стрессом являются основной причиной развития выраженных системных деструктивных изменений, в том числе и сердечно-сосудистой системы, у больных сахарным диабетом 2 типа. Симультанная патология у данной категории пациентов предъявляет определённые требования в фармакотерапии, необходимость коррекции не только нарушений углеводного, но липидного, белкового, активации процессов перекисного окисления липидов [1; 2]. Учитывая особенность патогенеза сахарного диабета 2 типа, необходимы лекарственные препараты с определённым фармакологическим спектром, включая гипогликемический, гиполипидемический, антиоксидантный эффекты. Однако из-за отсутствия в настоящее время подобного рода лекарственных препаратов возникает необходимость комбинирования нескольких фармпрепаратов.
Целью настоящего исследования явилось изучение фармакологических эффектов комбинации гипогликемического препарата вилдаглиптина (галвус) с этилметилгидроксипиридина сукцинатом при моделировании факторов риска развития сахарного диабета – в условиях дексаметазоновой гипергликемии на фоне гиперхолестеринемии.
Материал и методы исследования. Исследование проведено на 30 половозрелых крысах-альбиносах линии Вистар обоего пола массой 250-300 г на базе вивария ФГБОУ ВО «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва». Животные получены из питомника «Столбовая», ФГБУ «Научный центр биомедицинских технологий» РАМН. Все эксперименты, уход и содержание осуществлялись в соответствии с Директивой № 63 от 22 сентября 2010 года президиума и парламента Европы «О защите животных, используемых для научных исследований», «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» от 06.04.1993 и Приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». В соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [2005] максимально допустимое внутривенное введение жидкости белым нелинейным крысам составляет 2,0 мл/кг. Дизайн исследования утверждён Локальным этическим комитетом ФГБО ВО «МГУ им Н.П. Огарёва», протокол № 10 от 12 октября 2017 г.
Лабораторные животные случайным образом были разделены на группы по 6 особей (5 серий, 30 животных), изучали влияние вилдаглиптида и его комбинации с этилметилгидроксипиридина сукцинатом 50 мг/кг мг/кг (ЭМГП-сукцинат, мексидол) на выраженность гипергликемии в условиях сочетания дексаметазоновой нагрузки в сочетании с холестерином в виде масляной суспензии холестерина из расчета 40 мг на 1 кг массы тела животного, предварительно растворив в 0,5 мл растительного масла. С целью усиления пероксидного стресса к эмульсии добавляли витамин Д в дозе 12 500 ЕД на 1 кг массы. 1-я серия - интактные животные; 2-я – дексаметазон 800 мкг/кг; 3-я – дексаметазон 800 мкг/кг + вилдаглиптин 0,4 мг/кг; 4-я – дексаметазон 800 мкг/кг + холестерин перорально; 5-я – дексаметазон 800 мкг/кг + холестерин + вилдаглиптин 4 мг/кг + этилметилгидроксипиридина сукцинат 50 мг/кг мг/кг (ЭМГП-сукцинат).
На 5-е сутки эксперимента проводили тест толерантности к глюкозе, вводя 1 г глюкозы в виде 40% раствора с исследованием глюкозы в капиллярной крови из хвостовой вены, тест полосками Accu-Chek Active.
С целью выявления антиадренергической активности вилдаглиптина животным проводили тест на нагрузку адреналином гидрохлорида 0,1% 0.2 мл в/м.
По окончании эксперимента животных выводили из опыта эфирным наркозом в камере с последующей декапитацией.
Результаты исследования обработаны статистически с использованием пакета программ для статистической обработки Statisтica, статистические показатели обозначены следующими символами: М - среднее значение; m - ошибка среднего, ри - отличие от аналогичного показателя интактных животных; рк - отличие от аналогичного показателя контрольной группы. Для оценки достоверности различия использовали T-критерий Стьюдента. Значимыми считали различия при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Дексаметазоновая нагрузка в дозе 800 мкг/кг в течение 5 суток приводит к развитию стойкой гипергликемии у крыс, повышая значения глюкозы крови на 243% (рис. 1). Вилдаглиптин в дозе 0,4 мг/кг, вводимый перорально крысам, способствовал снижению гликемии на 118% по сравнению с данными серии без гипогликемического препарата, а через 48 часов значения показателя не отличались от данных интактных животных. Холестериновая нагрузка на фоне дексаметазона усугубляла степень гипергликемии – рост глюкозы составил 356% по отношению к интактным и 34% данных серии без холестерина (рис. 1).
Рис. 1. Динамика уровня глюкозы крови белых крыс на фоне введения дексаметазона в течение 5 суток и холестерина с коррекцией вилдаглиптином в дозе: 1 - интактные;
2 - контроль дексаметазон, 3 - дексаметазон + вилдаглиптин; 4 - дексаметазон + холестерин; 5 - дексаметазон + холестерин + вилдаглиптин. * - достоверность различия к данным 1 серии интактных животных; с - достоверность различия между 2 группой (контроль) и 3 ,4, 5; о - достоверность различия к данным 1-3 групп; v - достоверность различия 3 и 4 группе; z - достоверность различия между 4 и 5 группами
Терапия вилдаглиптином сочетанной дисметаболической патологии (комбинированного влияния дексаметазона и холестерина) значимо снижает риск развития гипергликемии, о чём свидетельствует уровень глюкозы крови крыс, сниженный на 95% относительно значений группы сравнения (без гипогликемического препарата). Таким образом, вилдаглиптин эффективно предупреждает развитие выраженной гипергликемии при комбинации факторов риска – гиперкортизонемии и гиперхолестеринемии, гипергликемии – наиболее опасных факторов системного повреждения при хроническом стрессорном воздействии.
Данные, полученные при проведении теста толерантности к глюкозе, свидетельствуют о нарушении регуляции инсулина у крыс в условиях гиперкортикостероидемии и гиперхолестеринемии (рис. 2). В норме значения глюкозы крови через 2 часа после пробы снижались на 29,8% от максимальных значений через 1 час. На фоне дексаметазона в эти же сроки значения глюкозы уменьшились лишь на 16,2%, что свидетельствует об уменьшении стимулирующего влияния глюкозы на выброс инсулина бета-клетками поджелудочной железы. В комбинации с холестерином дексаметазон усиливает негативную тенденцию, снижая уровень гликемии только на 11,6% от максимальных значений. Коррекция гипергликемии в комбинации с холестеринемией вилдаглиптином восстанавливает реакцию бета-клеток поджелудочной железы на нагрузку глюкозой – степень гликемии уменьшается на 30%, как и у интактных животных.
Рис. 2. Тест толерантности к глюкозе: 1-я серия - интактные животные;
2-я – дексаметазон; 3-я – дексаметазон + вилдаглиптин; 4-я – дексаметазон +холестерин; 5-я – дексаметазон + холестерин + вилдаглиптин.
* - достоверность различия к данным 1 серии интактных животных; с - достоверность различия между 2 группой (контроль ) и 3, 4, 5; v - достоверность различия 3 и 4 группе;
z - достоверность различия между 4 и 5 группами
Рис. 3. Показатели глюкозы крови по данным адреналинового теста у белых крыс:
1-я серия - интактные животные; 2-я – дексаметазон; 3-я – дексаметазон + вилдаглиптин; 4-я – дексаметазон + холестерин; 5-я – дексаметазон + холестерин + вилдаглиптин.
* - достоверность различия рассчитана между 1 серией и 2, 3, 4, 5..o – между сериями 2, 3, 4, 5; v - достоверность различия рассчитана между данными 4 и 5 серий
Реакция интактных животных на введение адреналина гидрохлорида проявляется в повышении глюкозы на 96% от исходного уровня (рис. 3). У животных на фоне дексаметазона увеличение глюкозы составило 116% (рост с 12,48±2,29 до 27,02± 3,31 ммоль/л). Вилдаглиптин предотвращает рост гликемии, сохраняя показатели практически на уровне интактных крыс и реакцию на адреналин. Гиперхолестеринемия существенно увеличивает показатели глюкозы и не стимулирует реакцию на адреналин, сохраняя значения гликемии на таком же уровне, как и до проведения теста с катехоламином, что, возможно, вызвано истощением резервов активации гликолиза, распадом гликогена и глюконеогенезом на фоне избытка глюкокортикостероидов. Подключение к терапии животным с сочетанными факторами риска (дексаметазон + холестерин + адреналин гидрохлорид) вилдаглиптина предотвращает рост гликемии, снижая показатели глюкозы с 20,6±3,68 в серии без гипогликемического препарата до 9,26±1,34 ммоль/л (на 116%), что, вероятно, обусловлено торможением глюконеогенеза, сохранением механизмов эндокринной регуляции обмена веществ, ингибированием дипептидпептизы-4, повышением чувствительности рецепторов тканей к инсулину, и, как следствие – снижение уровня глюкозы, т.е. реализуется антиадренергический метаболический эффект вилдаглиптина в условиях комбинированного воздействия нескольких факторов риска: высокого уровня глюкокортикостероидов, холестерина и катехоламинов, характерных для хронического стресса [3].
Многочисленными исследованиями установлена существенная роль окислительного стресса в реализации системного деструктивного влияния длительной гипергликемии, что приводит к повреждению не только структурных компонентов мембран клеток, но и белков. [1; 4; 5]. Прогрессивное развитие атеросклероза у больных с сахарным диабетом с развитием макро- и микроангиопатий – негативная особенность системных атеросклеротических поражений сосудов с развитием гангрены нижних конечностей, обширных некрозов миокарда [2]. В наших исследованиях было изучена роль вилдаглиптина и ЭМГП-сукцината (мексидола) при комбинировании нескольких факторов риска: высокого уровня глюкокортикостероидов, гликемии, холестерина и (однократно) катехоламинов, что моделирует условия острого стресса на фоне других факторов риска, аналогично метаболическому фону больных сахарным диабетом 2 типа.
Введение дексаметазона увеличивает содержание общего белка сыворотки крови на 9,8% в сравнении с интактными животными (табл. 1). Аналогична динамика содержания альбуминов сыворотки крови (+14,4%), что обусловлено стимулирующим действием глюкокортикоидов на синтез белков в печени. В условия гиперхолестеринемии на фоне введения вилдаглиптина данная положительная тенденция сохраняется. Этилметилгидроксипиридина сукцинат в дозе 50 мг/кг сохраняет исходные значения общего белка сыворотки и повышает уровень альбуминов 40,0 ± 3,74 г/л (табл. 1).
Высокие дозы глюкокортикостероидов значимо повышают синтез холестерина – на 142,4%, из-за активации глюконеогенеза, дисметаболической гиперлипидемии, усиленного катаболизма липидов. Вилдаглиптин уменьшает данную негативную тенденцию, однако цифры общего холестерина остаются выше значений интактных животных на 124% (табл. 1). Включение этилметилгидроксипиридина сукцината в дозе 50 мг/кг в комплексную терапию снижет уровень общего холестерина на 29% по отношению к серии без вилдаглиптина и на 19,4% более эффективен в снижении гиперхолестеринемии вилдаглиптином. Аналогичная динамика значений триглицеридемии в исследуемых сериях. Дексаметазон вызывает развитие выраженной гипертриглицеридемии: рост значений составил + 93,1% по отношению к показателям интактных животных, что также прогнозируемо фармакодинамическими эффектами глюкококортикостероидов – активацией липолиза и глюконеогенеза. Положительным эффектом вилдаглиптина можно считать его корригирующее влияние на рост триглицеридов в сыворотке крови в условиях гиперхолестеринемии и гиперглюкокортикостероидемии – снижение составило 60,2% по отношению к серии без вилдаглиптина.
Гипотриглицеридемический эффект сочетания этилметилгидроксипиридина сукцината с гипогликемическим средством более выражен (–38,3%), чем лишь монотерапия вилдаглиптином. Концентрация ЛПВП возрастает на фоне дексаметазона (+ 46%), что, вероятно, обусловлено усилением протеинсинтетической функции печени. Вилдаглиптин усиливает данную тенденцию, обеспечивая дальнейший рост ЛПВП (табл. 1). ЭМГП-сукцинат сохраняет показатели ЛПВП выше значений контроля, но в меньшей степени, чем гипогликемическое средство.
Таблица 1
Биохимические показатели крови белых крыс серии с этилметилгидроксипиридина сукцинатом на фоне дексаметазона, холестерина и вилдаглиптина (М ±m)
|
|
Показатели |
Общий белок, г/л |
Альбумины, г/л |
Общий холестерин, ммоль/л |
Триглицери- ды, ммоль/л |
ЛПВП, ммоль/л |
|
1 |
Интактные
|
66,4±4,9 |
34,42±0,81 |
0,66±0,09 |
1,02±о,31 |
0,40±0,04 |
|
2 |
Контроль дексаметазон + холестерин |
73,0±13,39 Ринт<0,001 |
39,36±4,43 Ринт<0,03
|
1,6±0,2 Ринт<0,001
|
1,97±0,30 Ринт<0,002
|
0,78 ±0,08 Ринт<0,01 |
|
3 |
Дексаметазон + холестерин + вилдаглиптин |
74,5±9,3 Ринт.>0,05 Рконт.>0,05 |
38,07±3,24 Ринт<0,04 Рконт.>0,05
|
1,48±0,34 ринт<0,001 Рконт.>0,05
|
1,23±0,19 ринт. <0,002 Рконт.>0,05
|
1,14±0,26 Ринт<0,01 Рконт <0,01 |
|
4 |
Этилметилгид-роксипиридина сукцинат + дексаметазон + холестерин+ вилдаглиптин |
67,4±7,36 Ринт.>0,05 Рконт >0,05 Рвил. >0,05 |
40,0 ± 3,74 Ринт<0,04 Рконт .>0,05 Рвил .>0,05 |
1,24±0,18 Ринт<0,001 Рконт<0,001 Рвил .>0,05
|
0,86±0,15 Ринт.>0,05 Рконт <0,001 Р вил<0,001
|
0,94±0,22 Ринт<0,001 Рвил >0,05 Рконт <0,001
|
Примечание: Ринт.<0,001 – достоверность рассчитана по отношению к интактным животным; Рконт.>0,05 – достоверность рассчитана по отношению к данным серии контроля; Рвил. – достоверность рассчитана по отношению к данным серии с вилдаглиптином.
Активность фермента АЛАТ возрастает на фоне гиперхолестеринемии и дексаметазона на 68% от уровня интактных животных (табл. 2) вследствие повышенной метаболической нагрузки на гепатоциты. Подключение 3-го компонента – вилдаглиптина 0,4 мг/кг в схему эксперимента приводит к существенному росту активности АЛАТ (+ 372%) к исходным данным и + 179% к данным предыдущей серии (без гипогликемического препарата), возможно, данный рост активности обусловлен выраженной метаболической перегрузкой печени. Однако введение этилметилгидроксипиридина сукцината в схему эксперимента обеспечило снижение значений АЛАТ на 60% по сравнению с предыдущей серией (табл. 2), что свидетельствует о гепатопротекторной активности антиоксиданта.
Таблица 2
Биохимические показатели серии с этилметилгидроксипиридина сукцинатом на фоне холестерина и вилдаглипдина, М±м
|
|
Показатели |
АЛАТ, ЕД |
АСАТ, ЕД
|
Мочевина, ммоль/л |
Креатинин, мг/дл |
|
1 |
Интактные |
55,8 ± 9,23 |
164,8±15,97 |
4,52±0,51 |
0,054±0.005 |
|
2 |
Контроль дексаметазон + холестерин |
94,2±6,97 Ринт<0,001 |
244.,6±8,62 Ринт<0,001 |
7,3±1,52 Ринт<0,004 |
0,055±0,003 Ринт<0,003 |
|
3 |
Дексаметазон + холестерин+ вилдаглиптин |
263,4±64,22 Ринт<0,03 Рконт <0,001 |
229,0±22,65 Ринт<0,001 Рконт >0,05 |
9,33±2,32 Ринт<0,001 Рконт .>0,05 |
0,065±0,006 Ринт<0,001 Рконт<0,02 |
|
4 |
Этилметилгид-роксипиридина +дексаметазон + холестерин + вилдаглиптин |
105,8±18,41 Ринт<0,001 Рконт >0,05 Р вил<0,001 |
258,6±38,16 Ринт<0,001 Рконт >0,05 Р вил.>0,05
|
7,42±2,29 Ринт<0,001 Рконт >0,05 Р вил.>0,05 |
0,057±0,005 Ринт>0,05 Конт >0,05 Рвил.<0,04 |
Примечание: Ринт<0,001 – достоверность рассчитана по отношению к интактным животным; Рконт.>0,05 – достоверность рассчитана по отношению к данным серии контроля; Рвил. – достоверность рассчитана по отношению к данным серии с вилдаглиптином.
Активность фермента АСАТ не изменялась в сериях эксперимента, что подтверждает сравнительно более выраженную чувствительность гепатоцитов к примененной интенсивной метаболической нагрузке холестерином, дексаметазоним и вилдаглиптином.
Нарастание продуктов метаболизма печени – мочевины (+ 62% в серии с холестерином, дексаметазоном и + 106% в серии с вилдаглиптином по отношению к интактным) на фоне ксенобиотиков также подтверждает предположение об усилении синтетических процессов, обусловленных повышенными дозами дексаметазона (табл. 2). Аналогична и динамика креатинина в сериях опытов – нарастание при увеличении метаболической нагрузки, однако в серии с этилметилгидроксипиридина сукцинатом значения креатинина не отличаются от интактных крыс, что, вероятно, обусловлено снижением метаболической нагрузки из-за стабилизации мембран лизосом гепатоцитов и снижения активности ферментов, участвующих в процеcсах микросомального окислении в гепатоцитах и биотрансформации ксенобиотиков [6-8].
Выводы
1. Холестериновая нагрузка усугубляет гипергликемию и снижает адаптацию инсулярного аппарата при дексаметазоновой гипергликемии.
2. Вилдаглиптин корригирует рост гипергликемии в условиях сочетанных метаболических нарушений и сохраняет регуляторную способность бета-клеток поджелудочной железы.
3. Комбинированное применение вилдаглиптина и ЭМГП-сукцината оказывает синергетический эффект в условиях дисметаболических нарушений, потенцирует снижение холестерина, триглицеридов и сохраняет высокий уровень ЛПВП.
4. ЭМГП-сукцинат проявляет гепатопротекторную активность в условиях дисметаболических нарушений, ограничивая рост ферментов (АЛАТ) и повышая альбуминосинтезирующую функцию печени при дислипидемии и гиперкортикостероидемии.