При сахарном диабете в значительной степени нарушается обеспечение клеток основными субстратами пластического и энергетического обмена и активность внутриклеточных ферментных систем гепатоцитов. В связи с этим уменьшаются функциональные возможности печени по поддержанию адекватного уровня метаболитов в крови, что сказывается на пластическом и энергетическом обмене других тканей, в том числе миокарда [1; 2]. Прием алкоголя вызывает выраженный метаболический стресс [3]. Поэтому алкогольная интоксикация, приводящая к интенсификации катаболических процессов, может усиливать нарушения обмена, наблюдаемые при сахарном диабете [4-6]. В раннем периоде алкогольной интоксикации, вызываемой у животных с экспериментальным аллоксановым диабетом, были обнаружены признаки активизации процессов катаболизма азотсодержащих соединений [7].
Целью исследования является изучение возможности восстановления параметров азотистого и энергетического обмена в период реституции после острой алкогольной интоксикации (ОАИ) у животных с экспериментальным сахарным диабетом.
Материалы и методы исследования
Эксперименты проведены на 42 белых крысах-самцах массой 220-250 г. Экспериментальный сахарный диабет создавали путем двукратного внутрибрюшинного введения 5% раствора аллоксана в дозе 135 мг/кг массы тела после 12-14-часового голодания. Вторая инъекция производилась через 12 суток после первой. Развитие сахарного диабета контролировали, определяя концентрацию глюкозы в крови и наличие кетоновых тел в моче. Острую алкогольную интоксикацию вызывали внутрибрюшинной инъекцией 25% этилового спирта в дозе 4 г/кг массы тела натощак, в таких условиях развивается выраженная алкогольная интоксикация [7].
Подопытные животные были разделены на 3 группы. 1-я группа - исходно здоровые крысы, у которых вызывали ОАИ, 2-я группа – животные, обследованные на 30-е сутки после первого введения аллоксана, 3-я группа – животные, у которых вызывали ОАИ на 30-е сутки аллоксанового диабета. Одновременно с подопытными животными были обследованы интактные крысы. Объединенная контрольная группа включала 18 крыс, в экспериментальных группах было по 7-9 животных.
Подопытных животных 1-й и 3-й группы забивали декапитацией через 24-26 ч после введения этанола. К этому времени концентрация этанола (определяли с помощью газового хроматографа «Кристалл 5000.2») в крови животных обеих групп возвратилась к нормальным значениям. В сыворотке крови с использованием стандартных биохимических методов определяли концентрацию глюкозы, лактата, мочевины, мочевой кислоты (МК), суммарное содержание свободных аминокислот (САК), триацилглицеролов (ТАГ) и свободных жирных кислот (СЖК). В гомогенатах печени определяли концентрацию гликогена и активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ, КФ 1.3.99.1), аланиновой аминотрасферазы (АлАТ, КФ 2.6.1.2), аспарагиновой аминотрансферазы (АсАТ, КФ 2.6.1.1), АМФ-дезаминазы (КФ 3.5.4.6) и глутаминазы (КФ 3.5.1.2), глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.3) [8], тирозиновой аминотрансферазы (ТАТ, КФ. 2.6.1.5) [9]. Те же показатели (за исключением глутаминазы и ТАТ) определяли в миокарде (левый желудочек). Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Через сутки после введения этанола исходно здоровым животным (1-я экспериментальная группа) большинство исследованных показателей приближалось к нормальным значениям. Наблюдалось лишь весьма значительное (почти в 4 раза по сравнению с контролем, p<0,01) увеличение содержания мочевины в сыворотке крови, снижение концентрации СЖК и повышение (на 36% по сравнению с контролем, p<0,05) активности ГДГ в ткани печени.
В проведенных нами ранее исследованиях было установлено [7], что у животных с аллоксановым диабетом через 6 часов после введения алкоголя (содержание этанола в крови повышено в 10-13 раз) наблюдается умеренно выраженная продукционная азотемия, повышается распад аминокислот и пуриновых нуклеотидов, нарушается утилизация амидов дикарбоновых аминокислот в печени.
Через 24-26 часов после введения алкоголя животным с аллоксановым диабетом (3-я экспериментальная группа) в сыворотке крови уровень мочевой кислоты и показатели липидного обмена были нормальными, а содержание мочевины в сыворотке крови оставалось значительно повышенным (таблица 1). Концентрация свободных аминокислот также была близка к нормальным значениям, т.е. повысилась (на 45%, P<0,01) в сравнении с величинами, характерными для крыс с экспериментальным сахарным диабетом. Такие изменения могут быть обусловлены повышением продукции аминокислот в результате распада белков. Колебания уровня молочной кислоты в сыворотке крови у животных 2-й и 3-й групп могут свидетельствовать об изменениях способности печени и миокарда утилизировать лактат при ОАИ.
В печени у крыс 3-й группы (таблица 2) сохранялась значительно повышенная, как и при 6-часовой алкогольной интоксикации [7], активность ГДГ. Изменения составили 30% по сравнению с контролем (p<0,05), по сравнению с животными 2-й группы показатель повышался почти в 2 раза (p<0,05). Была также увеличена по сравнению с контрольной группой активность АсАТ. Активность ТАТ, стимулируемой стероидными гормонами, повышалась на 29% (p<0,01) в сравнении с животными 2-й группы и достигла уровня контроля.
Таблица 1
Изменения концентрации метаболитов в сыворотке крови крыс при аллоксановом диабете и в период реституции после ОАИ (М±m)
|
Показатель |
Контрольная группа |
1-я группа |
2-я группа |
3-я группа |
|
Глюкоза, ммоль/л |
4,8±0,5 |
5,6±0,7 Рк>0,05 |
12,5±0,5 Рк<0,01 |
10,8±0,7 Р2-3<0,05 Р2-3>0,05 |
|
CЖК, мкмоль/л |
290±15 |
190±10 Рк<0,01 |
272±9 Рк>0,05 |
256±34 Рк>0,05 Р2-3>0,05 |
|
Лактат, ммоль/л |
1,44±0,03 |
1,54±0,09 Рк>0,05 |
1.20±0,05 Рк<0,01 |
1,47±0,04 Рк>0,05 Р2-3<0,05 |
|
ТАГ, ммоль/л |
0,74±0,06 |
0,81±0,20 Рк>0,05 |
0,71±0,05 Рк>0,05 |
0,62±0,04 Рк>0,05 Р2-3>0,05 |
|
Мочевина, ммоль/л |
5,02±0,29 |
19,1±4,0 Рк<0,01 |
10,6±0,6 Рк<0,01 |
17,3±3,4 Рк<0,01 Р2-3>0,05 |
|
САК, ммоль/л |
4,88±0,17 |
4,91±0,40 Рк>0,05 |
3,90±0,10 Рк<0,01 |
5,66±0,33 Рк>0,05 Р2-3<0,01 |
|
МК, мкмоль/л |
115±3 |
107±15 Рк>0,05 |
123±2 Рк>0,05 |
127±2 Рк>0,05 Р2-3>0,05 |
Примечания. Здесь и в табл. 2 и 3: 1) в объединенной контрольной группе было 18 животных, в экспериментальных группах представлены результаты, полученные при обследовании 7-8 животных; 2) Рк - характеристика достоверности различий между животными экспериментальных групп и контрольной группой. Р2-3 – характеристика достоверности различий между животными 2-й и 3-й групп.
Таблица 2
Изменения содержания гликогена и активности ферментов в ткани печени крыс при аллоксановом диабете и в период реституции после ОАИ (М±m)
|
Показатель |
Контрольная группа |
1-я группа |
2-я группа |
3-я группа |
|
Гликоген, мг*г ткани-1 |
4,28±0,31 |
4,78±0,32 Рк>0,05 |
4,65±0,63 Рк>0,05 |
7,59±0,62 Рк<0,01 Р2-3<0,01 |
|
АлАТ
|
29,4±2,5 |
26,1±2,8 Рк>0,05 |
38,0±4,1 Рк>0,05 |
34,5±1,7 Рк>0,05 Р2-3>0,05 |
|
АcАТ |
48,1±2,1 |
44,8±1,9 Рк>0,05 |
59,9±3,9 Рк<0,05 |
58,7±1,9 Рк<0,01 Р2-3>0,05 |
|
ГДГ |
2,10±0,12 |
2,85±0,22 Рк<0,05 |
1,43±0,17 Рк<0,05
|
2,74±0,17 Рк<0,05 Р2-3<0,01 |
|
Глутаминаза |
628±47 |
581±22 Рк>0,05 |
807±74 Рк>0,05 |
713±28 Рк>0,05 Р2-3>0,05 |
|
ТАТ |
162± 8 |
181±8 Рк>0,05 |
126±7 Рк<0,01 |
163±5 Рк>0,05 Р2-3<0,01 |
|
АМФ-дезаминаза |
263±8
|
279±16 Рк>0,05 |
257±16 Рк>0,05 |
194±8 Рк<0,01 Р2-3<0,05 |
|
СДГ |
3,17±0,22 |
3,06±0,24 |
4,07±0,47 |
4,35±0,09 Рк<0,01 Р2-3>0,05 |
Примечания. Активность аминотрансфераз, ГДГ и СДГ – в мкмоль*г ткани-1*мин-1, активность глутаминазы, АМФ-дезаминазы и ТАТ - в нмоль*г ткани-1*мин-1.
Такие изменения, а также заметное снижение активности АМФ-дезаминазы (на 26% по сравнению с контролем, p<0,01) свидетельствуют о том, что процессы азотистого обмена через сутки после введения алкоголя не стабилизировались. Сохранялись некоторые признаки увеличения катаболизма белков и аминокислот, из числа тех, которые обнаруживались в ранние сроки ОАИ [10]. Однако необходимо отметить, что только высокая активность ГДГ характерна именно для ОАИ, подобных изменений не наблюдалось в исходном состоянии (30-суточный экспериментальный сахарный диабет). У животных 3-й группы в сравнении с животными 2-й группы этот показатель был повышен почти в 2 раза (p<0,01). Это свидетельствует об интенсификации процессов дезаминирования аминокислот в печени. В то же время активность глутаминазы не отличается от уровня контроля. Поэтому можно предполагать, что утилизация транспортных форм аммиака в печени через 24-26 часов после введения алкоголя нормализуется.
Таблица 3
Изменения содержания гликогена и активности ферментов в миокарде крыс при аллоксановом диабете и в период реституции после ОАИ (М±m)
|
Показатель |
Контрольная группа |
1-я группа |
2-я группа |
3-я группа |
|
Гликоген, мг*г ткани-1 |
2,65±0,17 |
3,21±0,43 Рк>0,05 |
2,92±0,14 Рк>0,05 |
3,54±0,24 Рк<0,01 Р2-3<0,01 |
|
АлАТ |
3,18±0,24 |
3,00±0,12 Рк>0,05 |
4,20±0,40 Рк>0,05 |
2,54±0,26 Рк>0,05 Р2-3<0,01 |
|
АcАТ |
25,1±1,0 |
29,6±1,6 Рк>0,05 |
32,9±2,1 Рк<0,01 |
25,2±0,8 Рк>0,05 Р2-3<0,01 |
|
ГДГ |
129±14 |
132±38 Рк>0,05 |
165±23 Рк>0,05 |
159±11 Рк>0,05 Р2-3>0,05 |
|
АМФ-дезаминаза |
625±24 |
688±25 Рк>0,05 |
657±55 Рк>0,05 |
661±35 Рк>0,05 Р2-3>0,05 |
|
СДГ |
5,49±0,39 |
6,75±0,28 Рк>0,05
|
5,25±0,32 Рк>0,05
|
3,98±0,23 Рк>0,05 Р2-3>0,05 |
Примечания. Активность аминотрансфераз и СДГ – в мкмоль*г ткани-1*мин-1, активность ГДГ и АМФ-дезаминазы - в нмоль*г ткани-1*мин-1.
У животных 3-й группы повышение в ткани печени активности СДГ, являющейся маркерным ферментом митохондрий, может свидетельствовать об увеличении относительного количества митохондрий в печени и являться отражением реакции окислительных систем печени на алкогольную интоксикацию, развивающуюся на фоне сахарного диабета [11].
Обращает на себя внимание заметное повышение концентрации гликогена в обеих тканях у животных 3-й группы. Эти изменения наблюдались только через 24-26 часов после введения алкоголя животным с экспериментальным сахарным диабетом. Такие изменения могут рассматриваться как неблагоприятные. При ОАИ увеличивается продукция глюкокортикоидов [12; 13]. Результатом этого может быть увеличение (как и при сахарном диабете [1]) глюконеогенеза из аминокислот в печени и снижение использования углеводов миокардом, что и приводит к повышению концентрации гликогена в тканях в отдаленные сроки после ОАИ.
При исследовании миокарда не было выявлено каких-либо признаков повреждения исследованных ферментных систем азотистого обмена в результате алкогольной интоксикации у исходно здоровых животных (таблица 3). Активность ферментов, катализирующих конечные реакции дезаминирования (ГДГ и АМФ-дезаминаза), а также активность СДГ не изменялась во всех экспериментальных группах. У крыс 3-й группы ОАИ вызывала заметное снижение активности АлАТ (на 40%, р<0,01) и АсАТ (на 23%, р<0,01) в сравнении с животными 2-й группы. Но активность этих ферментов не выходила за пределы нормальных значений. В норме аминокислоты играют незначительную роль в энергообеспечении миокарда. Тем не менее механизм и значимость изменений процессов трансаминования для субстратного обеспечения синтеза белка в миокарде нуждаются в дальнейшем изучении.
Заключение
Оценивая в целом полученные результаты, можно отметить, что в период реституции после однократной алкогольной интоксикации, вызываемой у исходно здоровых животных и у животных с экспериментальным сахарным диабетом, наблюдается сходная динамика изменений показателей азотистого обмена. Не было обнаружено специфических стойких нарушений, которые могли бы свидетельствовать о существенном потенцировании повреждающего эффекта двух воздействий на азотистый и энергетический обмен. Можно лишь предполагать, что ОАИ, вызываемая на фоне аллоксанового диабета, обусловливала несколько более выраженный метаболический ответ на изменения продукции глюкокортикоидов. Полной стабилизации азотистого обмена в течение суток после оказанного воздействия не происходит.