Афферентные элементы в структуре интегративной системы первыми воспринимают изменения окружающей среды или испытывают воздействие антропогенного фактора [1]. Нейроны выполняют специфические функции с участием нейропептидов. Количественные различия белкового фонда в нейронах контрольной и опытной групп могут служить доказательством внешнего воздействия на организм, а также способны быть показателем адаптивных перестроек в определенных нейронных популяциях нервной системы, что подтверждают многочисленные исследования [2, 3].
Нуклеопротеидные комплексы – показатели уровня метаболических процессов. В течение последних десятилетий многие исследователи при изучении компенсаторных возможностей нервной системы в качестве показателя уровня синтетических реакций в нервных клетках оценивали хроматофильную субстанцию [4, 5]. Общие белки в нейронах, обеспечивающие основные функции нервных клеток, многократно изучались в норме и в эксперименте [6, 7]. Нейроспецифические структурные белки, определяющие форму, размеры, пространственное положение нейронов и осуществляющие внутриклеточный транспорт веществ, очень важны при изучении модульной организации спинного мозга и при исследовании спинномозговых ганглиев [8, 9].
Представитель отряда Грызуны – Крыса белая – представляет особый интерес как основной объект в научных исследованиях при изучении экстремальных воздействий на нервную систему – алкоголя или асфиксии. Крыса серая – полуподземное синантропное животное, приближенное к жилищу человека [10]. В процессе видообразования у нее сформировался металокомоторный тип двигательных реакций: при движении основной толчок обеспечивается поясом задних конечностей, передние являются амортизационными [11]. Крыса белая – лабораторный альбинос Крысы серой с аналогичным типом локомоции, испытывает влияние клеточного содержания: искусственное освещение, увеличение светового дня, отсутствие потребности постоянного поиска пищи. У животного происходят значительные изменения нейромышечных реакций двигательного анализатора. Крысу серую и Крысу белую можно сравнивать как серую и белую расы одного вида, различающиеся средой обитания и моторикой.
Цель исследования – сравнительный анализ количественных и качественных показателей белкового фонда нейронов слоя II–III коры больших полушарий головного мозга, клеток коры мозжечка и нейронов спинномозговых ганглиев шейного и поясничного отделов спинного мозга крыс в условиях модели антропогенного воздействия: алкоголь, асфиксия, клеточное содержание.
Материалы и методы исследования
На моделях антропогенного воздействия исследовалось влияние асфиксии на нейроны коры мозжечка, влияние алкоголя – на примере клеток слоя II–III коры головного мозга, воздействие клеточного содержания – на примере клеток спинномозговых узлов белых лабораторных крыс. Вышеперечисленные нейронные популяции как центробежные элементы в структуре двигательного анализатора первыми испытывают любое внешнее воздействие. В нейронах слоя II–III коры головного мозга изучали нуклеопротеидные комплексы, в нейронах мозжечка – общие белки, в нейронах спинномозговых ганглиев исследовали нейроспецифические структурные белки. Экспериментальные группы животных состояли в среднем из 9–10 особей. У представителей контрольных групп (из 9–10 животных) забирали передний мозг, мозжечок или спинной мозг и спинномозговые ганглии от шейного и поясничного отделов. Забор животных проводили в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приложение к приказу Министерства здравоохранения РФ от 12.08.1997 г. № 755) и рекомендациями Международного комитета по науке о лабораторных животных.
Влияние алкоголя изучали по методике В.Е. Высокогорского: перорально вводили этанол в дозах 8 г/кг и 4 г/кг массы животных (что соответствовало 2 мл и 1 мл 48%-ного раствора этанола на 100 г массы). Головной мозг у экспериментальных животных забирали через 1 час и через 1 сутки после введения алкоголя. Депарафинизированные срезы коры окрашивали тионином по Нисслю. В нейронах слоя II–III коры больших полушарий белых крыс с помощью морфометрического анализа исследовали нуклеопротеидные комплексы по степени хромофилии.
Экспериментальную модель асфиксии создавали путем пережатия интубационной трубки в течение 7 минут с последующим оживлением. Общие белки в клетках коры мозжечка изучали с помощью интерферометрии. Анализировали показатели белкового фонда (содержание и концентрацию) после асфиксии в остром периоде, через 1 час и через 1 сутки.
Влияние условий клеточного содержания на нервную систему животных изучалось на примере нейронов спинномозговых ганглиев шейного и поясничного отделов спинного мозга у представителей одного вида, различающихся средой обитания и двигательными реакциями. В качестве контрольной группы рассматривали синантропное животное – Крысу серую, адаптированную в процессе видообразования к полуподземному образу жизни. В качестве опытной группы изучали Крысу белую лабораторную – альбиноса Крысы серой, которая содержалась в клеточных условиях. Крысы серые были набраны в жилой зоне города Омска. Структурные белки в нейронах выявляли гистохимической реакцией с амидочерным 10Б. Содержание структурных белков и их концентрацию (т.е. среднее количество белка в одном пикселе) в клетках определяли цитофотометрией с применением системы анализа «Видео Тест Морфо-4» (Санкт-Петербург, 1999). Содержание (или массу) структурных белков в нейронах (цитофотометрические показатели интегральной оптической плотности белков, представляющие сумму локальных плотностей в клетках) условно обозначали в пикограммах. Среднюю оптическую плотность – средний показатель оптической плотности белков в 1 пикселе – расценивали как показатель концентрации структурных белков в нейронах.
Для оценки функционального уровня нейронов вычисляли функциональный ядерно-цитоплазматический коэффициент как соотношение содержания белков в ядре к содержанию белков в цитоплазме. Регуляторный уровень (регуляторный ядерно-цитоплазматический коэффициент) в нейронах ганглиев рассчитывали как соотношение концентрации белков в ядре к концентрации белков в цитоплазме. Показатели в тексте представлены как среднее значение ±среднеквадратичное отклонение.
Различия количественных показателей белков в нейронах мозжечка и результаты нуклеопротеидных комплексов в нейронах коры больших полушарий мозга обрабатывали параметрически, с применением критерия Стьюдента. Анализ на нормальность распределения показателей концентрации и содержания структурных белков в нейронах спинномозговых ганглиев проводили по критерию Колмогорова–Смирнова. Различия по каждому признаку в нейронах ганглиев серых и белых крыс выявляли с помощью дисперсионного анализа ANOVA (Краскела–Уоллиса). Взаимосвязи между цитохимическими показателями белкового фонда структурных белков у каждого животного определяли внутривидовым корреляционным анализом по Спирмену. Статистическую обработку количественных данных проводили по программам Excel и «Статистика-6».
Результаты исследования и их обсуждение
В процессе изучения компенсаторных явлений нервной системы при воздействии этанола 1-й группе лабораторных белых крыс вводили алкоголь из расчета 8 г/кг массы. При этом в нейронной популяции слоя II–III коры переднего мозга в сравнении с контролем отмечалось достоверное увеличение нейронов с явлениями хроматолиза цитоплазмы различной степени до появления клеток-теней. Количество клеток-теней возросло с 2,7% (в контроле) до 7,3% (в опыте) (Р≤0,01). Наблюдаемую крайнюю степень хроматолиза цитоплазмы (клетки-тени) мы относили к необратимым явлениям максимального снижения синтетических процессов и к истощению нейроцитов.
В нейронах коры больших полушарий экспериментальных животных 2-й группы под влиянием небольшой дозы алкоголя (4 г/кг массы) сохранялись явления хроматолиза, но выражены они в меньшей степени. Нарастало количество гиперхромных клеток. Компенсаторные проявления нейронов были связаны с увеличением в них размеров ядра и ядрышка. Количество гиперхромных клеток от общего числа составило 10,3% (в контрольной группе – 6,0%). Это происходило за счет уменьшения нейронов с гипохромной цитоплазмой. Подобные изменения, вероятно, обусловлены резким повышением уровня метаболических реакций. Они отражают обратимость нарушений в нейронах в ответ на воздействие этанола и выявляют определенный уровень компенсаторных возможностей клеток нейронной популяции слоя II–III коры полушарий головного мозга.
Асфиксию белых крыс с последующим оживлением проводили путем пережатия интубационной трубки. На заданных сроках в остром периоде после декапитации у животных забирали мозжечок. В латеральных участках полушарий мозжечка исследовались нейроны коры молекулярного слоя: малые звездчатые клетки, корзинчатые клетки; в ганглиозном слое – клетки Пуркинье; в зубчатом ядре – нейроциты больших и средних размеров. Интерферометрическое исследование звездчатых нейронов молекулярного слоя на ранних этапах после оживления показало достоверное увеличение показателей концентрации белков: через 1 час – до 1,29 пг/мкм3, что на 26,7% выше нормы; через 1 сутки – до 1,42 пг/мкм3, что на 39,2% больше, чем в контроле. В клетках Пуркинье ганглиозного слоя через 1 час после оживления содержание и концентрация общих белков в цитоплазме повышались и максимального значения достигли через сутки: концентрация составила 1,56 пг/мкм3 (Р≤ 0,001), что на 26,9% выше, чем в контроле, а содержание белков увеличилось на 35,5%. В нейронах зубчатого ядра на ранних сроках постреанимационного периода изменения концентрации и содержания белков были сходны с изменениями нейронов ганглиозного слоя, через сутки после оживления концентрация общих белков в которых составила 1,84 пг/мкм3 (Р≤0,001), что на 19% больше значений контрольной группы. Содержание белков увеличилось на 24% и составило 535,8 пг (Р≤0,001). Выявленная своеобразная резистентность нейронов молекулярного слоя мозжечка может быть связана с их функциональными особенностями регуляторного типа, изменяющими активность клеток ганглиозного слоя: они тормозят возбудимость клеток Пуркинье.
Сравнительная цитофотометрия нейронных популяций спинномозговых ганглиев полуподземных серых крыс и лабораторных белых крыс выявила различия количественных показателей структурных белков в нейронах. У крысы белой в сравнении с крысой серой в клетках шейного отдела количество белков оказалось меньше на 22,1% (Р≤0,001), а в клетках поясничного отдела, наоборот, больше на 36,6% (Р≤0,001). Причем в шейном отделе (ШО) более значимые изменения массы белков были выявлены в цитоплазме клеток (в цитоплазме – на 22,8%; в ядре – на 18,4%); в поясничном отделе (ПО), наоборот: в ядрах клеток в цитоплазме – на 35,4%, в ядре – на 40,6% (табл. 1).
Таблица 1
Показатели содержания структурных белков в нейронах спинномозговых ганглиев шейного и поясничного отделов крыс
|
Отдел |
Шейный |
Поясничный |
||||||
|
Показатели содержания белков |
Мт M±s |
Мц M±s |
Мя M±s |
фЯЦК M±s |
Мт M±s |
Мц M±s |
Мя M±s |
фЯЦК M±s |
|
Крыса серая |
141,4± 39,7 |
109,2± 32,7 |
32,1± 11,6 |
0,304± 0,06 |
117,6± 31,4 |
91,6± 29,0 |
25,9± 8,3 |
0,294± 0,11 |
|
Крыса белая |
110,2± 26,4 |
84,3± 21,4 |
26,2± 7,4 |
0,320± 0,08 |
185,4± 61,4 |
141,8± 47,9 |
43,6± 16,1 |
0,315± 0,08 |
* Мт – содержание белков в теле нейронов; Мц – содержание белков в цитоплазме; Мя – содержание белков в ядре; фЯЦК – функциональный ядерно-цитоплазматический коэффициент.
У крысы белой в сравнении с контролем показатели концентрации структурных белков коррелировали с их количеством: в нейронах шейного отдела значения концентрации также были меньше (на 24,0%) (Р≤0,001), в поясничном отделе, наоборот, больше (на 25,4%) (Р≤0,001). Причем в нейронах обоих отделов наиболее значительные изменения в распределении белков в 1 пикселе обнаружились в клеточных ядрах. В клетках шейного отдела концентрация белков в цитоплазме нейронов снизилась на 23,8% (Р≤0,001), а в ядре – на 26,3% (Р≤0,001). В поясничном отделе показатели концентрации, наоборот, возросли – в цитоплазме на 24,6% (Р≤0,001), в ядре – на 28,7% (Р≤0,001) (табл. 2).
Таблица 2
Показатели концентрации структурных белков в нейронах спинномозговых ганглиев шейного и поясничного отделов крыс
|
Отдел |
Шейный |
Поясничный |
||||||
|
Показатели концентрации белков |
Ст M±s |
Сц M±s |
Ся M±s |
рЯЦК M±s |
Ст M±s |
Сц M±s |
Ся M±s |
рЯЦК M±s |
|
Крыса серая |
0,343±0,06 |
0,353±0,06 |
0,315±0,06 |
0,890±0,09 |
0,311±0,06 |
0,319±0,04 |
0,286±0,05 |
0,897±0,1 |
|
Крыса белая |
0,261±0,04 |
0,269±0,04 |
0,232±0,05 |
0,861±0,07 |
0,417±0,08 |
0,423±0,08 |
0,401±0,08 |
0,943± 0,04 |
* Ст – концентрация белков в теле нейронов; Сц – концентрация белков в цитоплазме; Мя – концентрация белков в ядре; рЯЦК – регуляторный ядерно-цитоплазматический коэффициент.
В результате изменения количественных и качественных характеристик белков в нейронах лабораторной крысы ее показатели функционального и регуляторного коэффициентов в сравнении с крысой серой численно возросли (фЯЦК: в ШО – на 5,0%, в ПО – на 6,6%; рЯЦК: в ШО – на 26,3%, в ПО – на 4,9%).
Корреляционный анализ показал, что у крысы серой в нейронах ганглиев между концентрацией и количеством белка сформировались прямые умеренные связи. В клетках шейного отдела коэффициент корреляции Спирмена (r) составил 0,44, в поясничном – 0,27. У крысы белой характер корреляций не изменился: между содержанием и концентрацией белков также выявились умеренные положительные взаимосвязи (ШО: r=0,68; ПО: r=0,31), но коэффициенты корреляции численно превышали в шейном отделе – на 35,5%, в поясничном – на 12,9%.
Выводы
Таким образом, проведенные комплексные исследования по изучению влияния радикальных воздействий (алкоголя, асфиксии) на нейронные популяции определенных структур интегративной системы крыс, а также изменение нейромышечных реакций двигательного анализатора (вследствие изменения условий существования) выявили, что компенсаторные реакции, аналогично адаптивным механизмам нейронов, обусловлены изменением количественных показателей общих и структурных белков (содержанием и концентрацией) и качественными изменениями внутриклеточных метаболических процессов (степенью хромофилии).
- Степень воздействия алкоголя на нейроны слоя II–III коры переднего мозга находилась в прямой зависимости от его количества: большое количество алкоголя вызывало хроматолиз цитоплазмы до появления клеток-теней, что доказывало необратимость процессов обмена веществ. При введении умеренного количества алкоголя в нейронной популяции возросло количество гиперхромных клеток и снизилось число гипохромных нейронов. Размеры гиперхромных нейронов увеличивались. Подобные изменения мы рассматривали как предельные варианты компенсаторных реакций нейронов коры переднего мозга.
- Достоверное повышение концентрации и массы общих белков в нейронах коры молекулярного слоя, зубчатого ядра и ганглиозного слоя мозжечка на ранних этапах после оживления мы расценивали как активное включение компенсаторных возможностей нейронов при воздействии асфиксии, направленное на восстановление метаболизма белков и функций нейронов.
- Уменьшение количественных показателей структурных белков в клетках спинномозговых ганглиев шейного отдела, обеспечивающих механизмы афференции амортизационных конечностей, и увеличение количества и концентрации структурных белков в нейронах ганглиев поясничного отдела, отвечающих за афференцию пропульсивных конечностей у белых крыс клеточного содержания в сравнении с серыми синантропными животными, вероятно, обусловлены адаптивными механизмами нейронов при изменении нейромышечных реакций функционально различающихся передних и задних конечностей. Увеличение значений функционального и регуляторного коэффициентов у крысы белой расценивали как возможный вариант механизма адаптации нейронов спинномозговых узлов к условиям клеточного содержания на клеточно-популяционном уровне. Одинаковые корреляционные связи между показателями количества и концентрации структурных белков в нейронах ганглиев у серой и белой рас крыс можно объяснить их видовой особенностью.