Среди всех онкозаболеваний у женщин рак шейки матки (РШМ) представляет собой довольно распространенную патологию [1]. При этом РШМ, выявленный на ранних стадиях онкогенеза, хорошо поддается лечению. В связи с этим очень важным для современной медицины является совершенствование диагностических приемов.
В настоящее время одним из принятых диагностических методов служит жидкостная цитология (ЖЦ). «Влажная» фиксация исследуемого биоматериала, лежащая в основе метода ЖЦ, позволяет свести к минимуму наличие крови, бактерий и артефактов, а также сохранить иммунологические и морфологические особенности исследуемых клеток в неизменном виде, что выгодно отличает данный метод диагностики от других [2].
Дополнительным методом диагностики можно считать скрининг ряда онкомаркеров, таких как миРНК [3, 4]. МиРНК являются особыми низкомолекулярными РНК, участвующими в регуляции экспрессии генов на разных уровнях [5]. Они обладают высокой специфичностью и стабильностью [6]. Большую роль в онкогенезе выполняют онкогены миРНК-20а и -21. МиРНК-20a участвует в инвазии рака, усиливает пролиферацию и миграцию опухолевых клеток [7]. МиРНК-21 способствует росту опухоли, регулирует пролиферацию, апоптоз и миграцию клеток шейки матки (ШМ) [8]. Основываясь на литературных данных, мы выбрали миРНК-20а и -21 в качестве диагностических онкомаркеров.
Высокоинформативным приемом скрининга могут считаться исследования экзосом, участвующих в межклеточных взаимодействиях [9]. В состав экзосом могут входить различные комплексы молекул, такие как факторы передачи, ферменты обмена веществ, апоптотические белки (обозначается Alix), протеолитические протеины шапероны (защитные устройства для теплового шока: Hsp70 и Hsp90), а также миРНК [10]. Тот или иной молекулярный состав экзосом способен быть показателем определенных патологических либо естественных преобразований в клетках [11]. Доказано, что миРНК могут присутствовать в различных тканях и в природных жидкостях человеческого организма (в крови, моче), при этом они остаются стабильными в структуре подобных жидкостей достаточно долго [12]. Таким образом, оценка профиля определенных миРНК в экзосомах мочи может являться высокоинформативным показателем.
Целью настоящей работы была оценка эффективности метода жидкостной цитологии в комплексе с оценкой профиля экспрессии миРНК в экзосомах мочи при диагностике некоторых патологий рака шейки матки, таких как рак шейки матки и плоскоклеточные интраэпителиальные поражения шейки матки.
Материалы и методы исследования
Общая характеристика клинического исследования. Работа была выполнена на базе отделения онкогинекологии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России. В исследование были включены 120 пациенток с РШМ на стадиях T1a1-T2a1N0M0 и 50 пациенток с верифицированными гистологически плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями (ПИП) шейки матки высокой степени (ВС) и низкой степени (НС), наблюдавшиеся с 2015 г. по 2020 г., а также 55 здоровых женщин. Условием включения в исследование было наличие экспрессии миРНК-20а и миРНК-21 в экзосомах мочи. Для постановки диагноза основывались на результатах гистологического анализа в соответствии со стандартами диагностики злокачественных новообразований шейки матки и морфологической системой Бетесда.
Получение экзосом мочи. Для получения высокочистых экзосомальных мембран 20 мл собранной мочи центрифугировали при 17000 g в течение 15 минут при 24°C. Супернатант удаляли и инкубировали при комнатной температуре в течение 25 минут. Осадок ресуспендировали в 200 мкл изоляционного раствора (250 ммоль/л сахарозы и 10 ммоль/л триэтаноламин-HCl, pH 7,6) и 50 мкл 3,24 моль/л дитиотреитола (DTT), а затем центрифугировали при 17000 g в течение 15 мин при 24°C. Полученный супернатант собирали и объединяли с супернатантом, полученным ранее, и центрифугировали при 20000 g в течение 2 ч при 24°C. Гранулы экзосом растворяли в 50 мкл буфера Лэммли (0,6% мас./об. SDS, 3% об./об. глицерина, 18 ммоль/л Трис-HCl pH 6,8 и 0,003% мас./об. бромфенолового синего) и хранили при –20°C для дальнейшего использования [13].
Жидкостная цитология. Биообразцы собирали из области шейки матки стандартной пластиковой щеткой из набора «Cytoscreen» («Hologic», США), съемную головку которой с отобранным материалом погружали во флакон со стабилизирующим раствором «Cytoscreen». Затем приготавливали тонкослойные мазки, которые окрашивали по Романовскому в модификации Паппенгейма. Микроскопическое исследование препаратов производили с помощью светового микроскопа ЛОМО ЕС БИМАМ Р 11 при 100-кратном увеличении. При интерпретации результатов жидкостной цитологии использовали унифицированные термины системы Бетесда (The Bethesda System, TBS 2014).
Оценка экспрессии миРНК. В работе определяли уровень экспрессии миРНК-20a, -21, -23b и -375. Выделение тотальной РНК из мочи осуществляли сорбентным методом набором «АмплиПрайм РИБО-сорб» («НекстБио», Россия). Образцы обрабатывали ДНКазой (6 ед. активности) в течение 40 мин при комнатной температуре в соответствующем буфере (реагенты «Applied Biosystems», США). Для проведения обратной транскрипции использовали набор «High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit» («Applied Biosystems», США). Экспрессию миРНК в экзосомах мочи определяли методом ПЦР в реальном времени с использованием термоциклера «Bio-Rad CFX96» («Bio-Rad», США) и программного обеспечения «Bio-Rad CFX Manager». При этом сравнивали величины пороговых циклов Ct изучаемой и референсной миРНК. Референсными локусами служили миРНК U6 snRNA. Образец везикул мочи исследовали, если экспрессию локуса U6 snRNA обнаруживали при значении порогового цикла Ct до 45 циклов. В каждом образце миРНК амплифицировали трехкратно и рассчитывали усредненное значение порогового цикла Ct. Уровень экспрессии миРНК (RE) был рассчитан по методу Pfaffl M.W. [14]. Уровень экспрессии выражается в условных единицах.
Статистический анализ результатов. При статистическом анализе применяли методы описательной статистики. Для выражения экспрессии миРНК использовали среднее значение и стандартную ошибку средней. При сравнении средних величин применяли критерий Манна–Уитни. Проводили ROC-анализ. Статистический анализ результатов осуществляли с использованием программы Statistica 12.0 (StatSoft, США).
Результаты исследования и их обсуждение
Частота встречаемости миРНК в экзосомах мочи у пациенток с РШМ, ПИП ВС и здоровых приведена в таблице 1. МиРНК-20а, миРНК-21 и миРНК-375 в экзосомах мочи встречались часто (˃70%), а миРНК-23b в экзосомах мочи – редко и независимо от патологии шейки матки, что делает исследование ее экспрессии нецелесообразным. Различий в экспрессии миРНК-20а и миРНК-375 в подгруппах пациенток не наблюдалось. Напротив, миРНК-21 чаще экспрессировалась у пациенток с РШМ (85,5%) и ПИП ВС (86,8%) по сравнению со здоровыми пациентками (69,1%).
Таблица 1
Частота выявления миРНК (абс. (%)) в экзосомах мочи у пациенток в зависимости от патологии шейки матки
миРНК |
РШМ (n=145) |
ПИП ВС (n=91) |
Здоровые (n=55) |
р |
миРНК-20а |
136 (93,8%) |
84 (92,3%) |
47 (85,5%) |
рмн>0,05 р1>0,05 р2>0,05 р3>0,05 |
миРНК-21 |
124 (85,5%) |
79 (86,8%) |
38 (69,1%) |
рмн=0,01 р1>0,05 р2=0,015 р3=0,017 |
миРНК-23b |
17 (11,7%) |
13 (14,3%) |
11 (20%) |
рмн>0,05 р1>0,05 р2>0,05 р3>0,05 |
миРНК-375 |
102 (70,3%) |
63 (69,2%) |
40 (72,7%) |
рмн>0,05 р1>0,05 р2>0,05 р3>0,05 |
Примечание: р – доверительная вероятность, р1 – «РШМ» vs «ПИП ВС», р2 – «РШМ» vs «ПИП НС», р3 – «ПИП ВС» vs «ПИП НС», рмн – множественное сравнение всех подгрупп (мн).
У женщин с РШМ, в отличие от здоровых, уровень экспрессии миРНК-20а в экзосомах мочи был повышен: 0,68±0,13 против 0,06±0,05 (р=0,0001). ROC-анализ показал, что если экспрессия миРНК-20а в экзосомах мочи у пациенток была выше 0,46, то с диагностической чувствительностью 86,8% и специфичностью 82,1% можно говорить о наличии РШМ. При этом площадь под ROC-кривой составила 0,831±0,057, что свидетельствует о хорошем качестве генетического теста (z=5,78, p<0,0001). Экспрессия миРНК-20а в экзосомах мочи у пациенток с РШМ (0,68±0,13) и ПИП ВС (0,32±0,11) статистически значимо различалась (р=0,004). Если экспрессия миРНК-20а в экзосомах мочи у пациенток с патологией шейки матки превышала разделительный уровень 0,53, то с диагностической чувствительностью 91,2% и специфичностью 76% это свидетельствует в пользу диагноза РШМ, а не ПИП ВС, при этом площадь под ROC-кривой составила 0,853±0,050, что свидетельствует о хорошем качестве генетического теста (z=6,87, p<0,0001), сопоставимом диагностике РШМ.
В отношении миРНК-21 установлен высокий уровень экспрессии в экзосомах мочи как при РШМ (0,99±0,15), так и при ПИП ВС (0,78±0,22). При превышении экспрессии миРНК-21 в экзосомах мочи у пациенток разделительного уровня 0,41 с диагностической чувствительностью 92,5% и специфичностью 65,5% можно говорить о РШМ, при этом площадь под ROC-кривой составила 0,805±0,056, что свидетельствует о хорошем качестве генетического теста (z=5,43, p<0,0001). При дифференциальной диагностике РШМ и ПИП ВС по экспрессии миРНК-21 в экзосомах мочи площадь под ROC-кривой имела низкое значение (0,572±0,071), что говорит о низком качестве генетического теста.
Таким образом, было выявлено усиление экспрессии проопухолевых миРНК-20а и -21, что согласуется с литературными данными, согласно которым данные РНК выступают в качестве онкогенных факторов [8, 15].
Уровни экспрессии миРНК-375 в экзосомах мочи у пациенток с РШМ (–0,562±0,08) и у здоровых (–0,04±0,01) статистически значимо различались (р=0,002). Если экспрессия миРНК-375 в экзосомах мочи у пациенток ниже –0,45, то с диагностической чувствительностью 76,9% и специфичностью 79,3% можно сделать вывод о наличии РШМ, при этом площадь под ROC-кривой составила 0,840±0,048, что свидетельствовало о хорошем качестве генетического теста (z=7,04, p<0,0001). У пациенток с ПИП ВС уровень экспрессии миРНК-375 был низким (–0,13±0,06). Различие экспрессии изучаемой миРНК между пациентками с РШМ и ПИП ВС было статистически значимым (р=0,005). Если экспрессия миРНК-375 в экзосомах мочи у пациенток была ниже разделительного уровня –0,50, то с диагностической чувствительностью 87,2% и специфичностью 58,6% можно сформировать заключение о РШМ как альтернативе ПИП ВС. Площадь под ROC-кривой составляла 0,727±0,062, генетический тест разграничения ПИП ВС и РШМ по уровню экспрессии миРНК-375 в экзосомах мочи был статистически значимым (z=3,63, p<0,0003). Таким образом, при снижении уровня экспрессии миРНК-375 повышается вероятность развития РШМ, что согласуется с литературными данными, согласно которым сверхэкспрессия миРНК-375 способствует подавлению пролиферации клеток, повышению активности лактатдегидрогеназы и индуцированию апоптоза в клетках рака шейки матки HPV-18 (+). В еще одной работе было показано, что сверхэкспрессия миРНК-375 усиливает активность каспазы-3 и каспазы-9 и подавляет экспрессию циклина D1 и белка сурвивина в клетках рака шейки матки HPV-18 (+) [16, 17].
Итак, наиболее информативным можно считать метод анализа экспрессии миРНК-20а и сравнения ее уровня с найденными точками cut-off для разделения состояний РШМ и норма, РШМ и ПИП ВС, а также уровня миРНК-21 для диагностики РШМ. Эти миРНК были использованы для оптимизации метода жидкостной цитологии: миРНК-21 для диагностики РШМ, а миРНК-20а для дифференциальной диагностики РШМ и ПИП. Под оптимизацией метода понимается корректировка его результатов с помощью генетических методов.
При диагностике только методом жидкостной цитологии диагноз совпал у 86 (71,7%) из 120 пациенток с РШМ (табл. 2).
Таблица 2
Таблица информативности жидкостной цитологии по выявлению РШМ
Методы |
Гистологическое заключение |
Итого |
|
Заключение жидкостной цитологии |
РШМ |
Нет РШМ |
|
Совпало с гистологическим |
86 |
11 |
97 |
Не совпало |
34 |
44 |
78 |
Итого |
120 |
55 |
175 |
Из 120 больных РШМ повышение уровня экспрессии миРНК-21 в экзосомах мочи выше разделительного уровня 0,41 отмечалось у 111 пациенток. При оценке риска развития РШМ по анализу экспрессии миРНК-21 в экзосомах мочи диагностическая чувствительность составляла 92,5%, а специфичность – 65,5%.
Статистическая матрица для расчета информативности оптимизированной жидкостной цитологии в целях выявления РШМ отражена в таблице 3. Диагностическая чувствительность оптимизированной жидкостной цитологии с помощью генетических методов оценки экспрессии миРНК-21 в экзосомах мочи для определения риска развития РШМ составила 80%. Таким образом, оптимизация жидкостной цитологии путем оценки уровня экспрессии миРНК-21 в экзосомах мочи позволила повысить диагностическую чувствительность с 71,7% до 80%.
Таблица 3
Таблица информативности жидкостной цитологии, оптимизированной при помощи генетических методов, для выявления РШМ
Методы |
Гистологическое заключение |
Итого |
|
Заключение жидкостной цитологии и оценки экспрессии миРНК-20а в экзосомах |
РШМ |
Нет РШМ |
|
Совпало с гистологическим |
96 |
11 |
107 |
Не совпало |
14 |
44 |
58 |
Итого |
120 |
55 |
175 |
Диагностическая чувствительность жидкостной цитологии, проводимой с целью дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС, составляла 75,4%, а специфичность – 76% (табл. 4).
Таблица 4
Таблица информативности дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС путем жидкостной цитологии
Методы |
Гистологическое заключение |
Итого |
|
Заключение жидкостной цитологии |
РШМ |
ПИП ВС |
|
Положительное (РШМ) |
86 |
12 |
98 |
Отрицательное (Нет РШМ, есть ПИП ВС) |
28 |
38 |
66 |
Итого |
114 |
50 |
164 |
Повышение экспрессии миРНК-20а в экзосомах мочи выше разделительного уровня 0,53 наблюдалось у 104 из 114 больных РШМ. Диагностическая чувствительность дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС по анализу экспрессии миРНК-20а в экзосомах мочи составила 91,2%, а специфичность метода – 76%.
Статистическая матрица для расчета информативности оптимизированной жидкостной цитологии для дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС отражена в таблице 5.
Таблица 5
Таблица информативности жидкостной цитологии, оптимизированной при помощи генетических методов, для дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС
Методы |
Гистологическое заключение |
Итого |
|
Заключение жидкостной цитологии и оценки экспрессии миРНК-20а в экзосомах |
РШМ |
ПИП ВС |
|
Положительное |
94 |
4 |
98 |
Отрицательное |
20 |
46 |
66 |
Итого |
114 |
50 |
164 |
Диагностическая чувствительность оптимизированной жидкостной цитологии с помощью генетического метода оценки экспрессии миРНК-20а в экзосомах для дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС составила 82,5%, а специфичность – 92%. Таким образом, оптимизация жидкостной цитологии путем оценки экспрессии миРНК-20а в экзосомах мочи позволила повысить диагностическую чувствительность при дифференциальной диагностике РШМ и ПИП ВС с 75,4% до 82,5%, а диагностическую специфичность – с 76% до 92%.
Заключение
Выбранные для проведения исследования миРНК могут использоваться для оптимизации жидкостной цитологии вследствие своей информативности. Анализ уровня экспрессии миРНК-20а рекомендуется применять для дифференциальной диагностики состояний РШМ и норма, РШМ и ПИП ВС, а уровня миРНК-21 – для диагностики РШМ.
Оптимизация жидкостной цитологии с помощью анализа экспрессии миРНК-21 в экзосомах мочи позволила повысить диагностическую чувствительность с 71,7% до 80%. А при комплексировании жидкостной цитологии с оценкой уровня экспрессии миРНК-20а наблюдалось увеличение диагностической чувствительности дифференциальной диагностики РШМ и ПИП ВС с 75,4% до 82,5%, а специфичности – с 76% до 92%.
В заключение следует отметить, что одним из преимуществ оптимизированной жидкостной цитологии с помощью оценки уровня экспрессии миРНК в экзосомах мочи является сочетание высокой информативности с неинвазивным способом забора биоматериала для анализа. Комплексирование общепризнанного метода жидкостной цитологии с генетическими методами оценки экспрессии онкомаркеров позволит расширить возможности диагностической помощи больным РШМ на ранних стадиях.