По современным представлениям, системная склеродермия – это хроническое аутоиммунное заболевание с несомненно прогрессирующим течением, сопровождающееся склеродермическим поражением кожи, органными изменениями и ангиопатиями [1].
Изучение системной склеродермии ведется на протяжении многих лет, но полностью изучить эту проблему не предоставляется возможным. Затрудняют ее диагностику большой полиморфизм и вариабельность клинической картины системной склеродермии, не полностью изученный патогенез заболевания [2–4].
Поиск маркеров системного склероза продолжается до настоящего времени. В патогенезе склеродермического процесса все чаще ведущую роль отводят свободнорадикальным механизмам тканевого повреждения, при которых, несомненно, большую роль играют активные формы кислорода (АФК). В организме существует антиоксидантная система (АОС), которая держит под контролем продукцию АФК и способна, в свою очередь, регулировать окислительные процессы в ней. В эту систему входит целый ряд энзимов, которые катализируют патогенный эффект активных форм кислорода. В условиях аутоиммунной патологии (в данном случае речь идет о склеродермическом процессе) происходят активация ПОЛ и окислительная реакция белков. Очевидно, это осуществляется за счет фрагментации или агрегации белковых молекул. Окислительная реакция аминокислот ферментов приводит к изменению структуры белка, его оксидазной активности, а также к изменению иммунологических свойств – к антителообразованию. При склеродермии также происходит выработка антител к ферментам АОС и, в частности, к глутатионредуктазе (ГР) [5, 6]. Глутатионредуктаза – фермент, который катализирует восстановление окисленного глутатиона. Восстановленный глутатион принимает непосредственное участие в глутатионпероксидазной реакции; кроме этого, он обладает еще и антиоксидантным действием. Мы неслучайно выбрали этот фермент для исследования: обладая мультиферментными свойствами, ГР является одним из важных ферментов-антиоксидантов. Аутоиммунные сдвиги при склеродермическом процессе, возникновение антигенных детерминант глутатионредуктазы могут происходить как в результате ее участия в дезактивации АФК, так и при индукции антител к ней. Глутатионредуктаза играет немаловажную роль в патогенезе ревматических заболеваний. Основное место содержания глутатионредуктазы – это растворимые части клеток, но выделяют и мембраносвязанные формы фермента. ГР также играет немаловажную роль в защите структуры эритроцитов от возникающих перекисных соединений. Более существенная активация процесса перекисного окисления липидов происходит именно на уровне мембраны эритроцита, степень которой часто зависит от структуры мембраны и первоначальной активности ферментов, связанных с мембраной. Активность глутатионредуктазы резко повышается в сыворотке крови человека при инфаркте, а в эритроцитах – при наследственной недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, поэтому этот фермент и используют в диагностических целях [7]. При склеродермическом процессе возникает дисбаланс между синтезом и утилизацией кислорода. Причины его возникновения не совсем изучены. Одним из факторов функциональной недостаточности энзимов является образование антител (АТ) к ним. В результате взаимодействия глутатионредуктазы со свободными радикалами происходят изменение стереометрии молекулы ГР и непосредственная блокада ее активных центров, что, в свою очередь, приводит к снижению ферментативной активности данного фермента. Даже повышенный синтез фермента не может полностью компенсировать его ферментативной недостаточности в условиях такого аутоагрессивного склеродермического процесса [8, 9].
Цель исследования: изучение роли антител к глутатионредуктазе в патогенезе, диагностике, прогнозе при склеродермическом процессе.
Материалы и методы исследования
В исследование были включены 30 доноров областной станции переливания крови г. Волгограда и 45 больных ССД отделения ревматологии ГУЗ ГБ№ 25 г. Волгограда. Все пациенты подписали информированное согласие на обследование, которое проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Международной медицинской ассоциации пересмотра 2013 г. (ACR/EULAR). В исследование были включены пациенты старше 18 лет, имеющие подтвержденный диагноз ССД. В исследовании использовалась ГР с активностью 340 Ед/мг, активность ГР определяли по методу Hosoda и Nakamura, описанному М.А. Шифриным (1977).
Концентрацию антител к ГР определяли иммуноферментным методом с использованием магнитосорбентов (И.П. Гонтарь и соавт., 2002 г.) [10]. Благодаря научным изысканиям в иммунодиагностике ревматических заболеваний было выявлено, что именно иммуноферментные методы анализа (ИФА) с применением магнитоуправляемых сорбентов приводят к повышению стабильности иммобилизованного антигена. Именно за счет иммобилизации биологически активных веществ в поверхностном слое гранулы происходит повышение концентрации данного антигена в реакционной зоне, что приводит к увеличению чувствительности данного метода. За счет включения магнитного материала в гранулы происходит ускорение всех манипуляций исследования, а это, в свою очередь, улучшает качественные характеристики проведенных исследований.
Обработка полученных данных проводилась с применением программного пакета Statistica 6,0 for Windows. Выборочные характеристики выражались как среднее значение (М) и стандартное отклонение (s). Полученные результаты оценивали в единицах оптической плотности (е.о.п.) и считали положительными при превышении величин экстинкции, найденных для здоровых лиц, более чем на 2s.Связь между количественными признаками определяли методом корреляционного анализа. Полученные результаты оценивались с помощью величины p (p-value) – вероятности того, что получаемый в исследовании эффект носит случайный характер. Значение p<0,05 было принято условием статистической значимости различий значений.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате исследований была определена средняя концентрация АТ к ГР в донорских сыворотках, которая по данным иммуноферментного анализа составила 0,080±0,004 е.о.п. Показатели, которые превышали эти значения на величину 2 стандартных отклонений, были приняты за верхнюю границу нормы: для АТ к ГР – 0,124 е.о.п. Общая активность ГР составила 114,3±3,7 МЕ, амплитуда колебаний величины активности – 73,4–154,0 МЕ. При исследовании больных ССД были выявлены достоверное уменьшение энзиматической активности фермента и увеличение количества антител к глутатионредуктазе по сравнению с донорами (р<0,001) (табл. 1).
Таблица 1
Активность ГР и антитела к ней у больных системной склеродермией в зависимости от активности заболевания
Группа |
Больные n |
Активность ГР, Ед/мл (M±m) |
АТ к ГР, е.о.п. (M±m) |
Здоровые Доноры |
30 |
114,3±3,7 |
0,080±0,004 |
Больные ССД, I степень активности |
20 |
86,4±3,6 |
0,132±0,004 |
II–III степени активности |
25 |
63,2±3,1 |
0,184±0,003 |
Снижение биохимической активности ГР, очевидно, связано с образованием специфических антител к энзиму в результате изменения стереометрии молекулы фермента и блокады его активных центров, которое и запускает основной биохимический механизм окисления свободных радикалов. Именно взаимодействие фермента с АФК и продуктами свободнорадикальных процессов, очевидно, и изменяет стереометрию молекулы энзима, что и приводит к экспрессии скрытых антигенных детерминант глутатионредуктазы, в связи с чем она и приобретает свойства аутоантигена. Анализ количества антител к глутатионредуктазе выявил тесную взаимосвязь с активностью системной склеродермии. Умеренная и высокая активность превышала значения у пациентов с низкой активностью заболевания, и она была достоверно выше значения здоровых лиц (р<0,001). Рост содержания специфических аутоантител и снижение активности фермента в крови больных ССД происходили с повышением активности склеродермического процесса, что соответствовало минимальной и умеренно-максимальной степени активности заболевания (р<0,001). Перед выпиской из стационара у больных системной склеродермией на фоне улучшения клинико-лабораторных показателей происходило увеличение активности исследуемого фермента. Это было связано с уменьшением активности склеродермического процесса на фоне проводимой иммуносупрессивной терапии с включением плазмафереза, при этом отмечалось и уменьшение количества специфических аутоантител.
Одним из основных факторов, определяющих прогноз ССД, является характер течения склеродермического процесса. У больных со ССД с хроническим течением при поступлении в стационар было выявлено повышение уровня антител к изучаемому ферменту по сравнению с донорами. У больных с подострым и острым течением заболевания при поступлении в стационар уровень антител к глутатионредуктазе значительно превосходил аналогичные показатели доноров (р<0,001) и больных с хроническим вариантом течения ССД (р<0,05). Статистически значимых различий при определении ферментативной активности ГР у больных ССД в зависимости от течения заболевания выявлено не было (табл. 2).
Таблица 2
Активность ГР и антитела к ней у больных ССД в зависимости от течения заболевания
Течение |
Больные n |
Время обследования |
Активность ГР, Ед/мг (M±m) |
АТ к ГР, е.о.п. (M±m) |
Хроническое |
20 |
До лечения После лечения |
112±2,8 115,7±2,6 |
0,136*±0,008 0,096±0,06 |
Подострое и острое |
25 |
До лечения После лечения |
70,3*±2,5 98,2±1,7 |
0,178*#±0,116 0,112±0,009 |
* – p<0,001 (с донорами)
# – р<0,05( между клиническими группами)
Нами было проведено исследование влияния стадии заболевания на содержание антител к ГР у больных системной склеродермией (табл. 3).
Таблица 3
Содержание антител к ГР у больных ССД в зависимости от стадии заболевания
Показатель |
I стадия |
II стадия |
III стадия |
Количество больных |
10 |
29 |
6 |
АТ к ГР, е.о.п.(М±m) |
0,124±0,022 |
0,162±0,017 |
0,324±0,024* |
* – р<0,05
Была выявлена зависимость уровня антител от стадии заболевания. После проведенного лечения у больных ССД отмечалось снижение концентрации сывороточных АТ к ГР (р<0,001). Достоверных изменений активности ГР на различных стадиях системной склеродермии выявлено не было.
Была проанализирована взаимосвязь различных клинических проявлений у больных ССД с наличием антител к глутатионредуктазе. Результаты исследований показали достоверное повышение антител к ГР у больных ССД с поражением различных органов и систем во всех клинических группах, но наиболее высокий уровень исследуемых антител наблюдался у пациентов с поражением сердца и легких (р<0,001). Кардиальная патология по типу ИБС и некоронарогенного кардиосклероза была выявлена у 25 положительных по АТ к ГР, поражение легких – у 20 пациентов (табл. 4).
Таблица 4.
Уровень антител к ГР у больных ССД в зависимости от клинических проявлений заболевания
Группы |
Больные n |
До лечения АТ к ГР, е.о.п. M (m) |
После лечения АТ к ГР е.о.п. M (m) |
Поражение кожи |
45 |
0,156 (0,024) |
0,108* (0,028) |
Поражение костно-мышечной системы |
45 |
0,110 (0,004) |
0,086*(0,009) |
Поражение сердца |
25 |
0,129 (0,004) |
0,102* (0,004) |
Поражение легких |
35 |
0,118 (0,008) |
0,074* (0,007) |
Синдром Рейно |
32 |
0,086 (0,004) |
0,072 (0,004) |
Поражение ЖКТ |
33 |
0,085 (0,014) |
0,076 (0,07) |
Поражение нервной системы |
12 |
0,094 (0,006) |
0,069 (0,004) |
* – р<0,05
Уменьшение ферментативной активности глутатионредуктазы приводит к появлению сердечно-сосудистых заболеваний, а образующиеся антитела к глутатионредуктазе, в свою очередь, резко снижают антиоксидантную активность этого энзима и еще больше усугубляют атеросклеротический процесс. Отсюда следует, что в патогенезе ишемии при системной склеродермии большую роль играют и иммунные механизмы, связанные с выработкой АТ к ГР.
Высокий уровень АТ к ГР и низкая ферментативная активность энзима приводят и к поражению легочной ткани. Выявлено, что при склеродермическом процессе происходит развитие фиброзирующего альвеолита и интерстициального фиброза за счет иммунных нарушений, которые возникают вследствие увеличения свободнорадикальных реакций и процессов фиброгенеза.
Динамическое изучение показателей содержания АТ к ГР в крови больных склеродермическим процессом позволило установить, что к концу пребывания пациентов в стационаре происходило достоверное их снижение (р<0,001) и увеличение активности фермента. При изучении вида проводимой терапии на содержание антител к глутатионредуктазе в крови больных ССД было выявлено, что наиболее выраженный эффект лечения наблюдался у пациентов с применением плазмафереза в сочетании с глюкокортикостероидными препаратами, отмечалась отчетливая тенденция к уменьшению количества антител к ГР (р<0,05); перед выпиской из стационара уровень антител к ГР был на уровне границы нормы (табл. 5).
Таблица 5
Динамика активности ГР и антител к глутатионредуктазе в процессе лечения.
Больные (n) |
Показатель |
При поступлении |
При выписке |
Все больные ССД (n=45) |
Активность ГР, мкГР/мл Уровень АТ к ГЛ е.о.п. |
64,2±1,16
0,175±0,008 |
67,3±1,18
0,105±0,010
|
Лечение цитотоксическими препаратами в комбинации с кортикостероидами (n=10) |
Активность ГР, мкГР/мл Уровень АТ к ГР е.о.п. |
63,9±1,8
0,184*±0,011 |
79,6±0,34
0,106±0,008 |
Комплексная терапия с включением плазмафереза (n=15) |
Активность ГР, мкГЛ/мл Уровень АТ к ГР, е.о.п. |
62,1±0.42
0,189*±0,006 |
78,1±0,32
0,092±0,008 |
*р<0,05
Включение в комплексное лечение больных склеродермией глюкокортикостероидных препаратов и экстракорпоральных методов, особенно плазмафереза, способствует снижению интенсивности антителогенеза и уменьшению активности склеродермического процесса.
Заключение
Полученные нами результаты исследований – снижение ферментативной активности глутатионредуктазы, увеличение количества антител к ней – могут служить дополнительным диагностическим критерием при системной склеродермии. Образующиеся аутоантитела к ГР могут явиться одной из причин снижения антиоксидантной активности фермента, а изучение взаимосвязи изменений иммунологической системы и биохимической активности энзима может быть использовано для уточнения патогенетических механизмов развития болезни. Таким образом, данные проведенного исследования представляют несомненный интерес для дальнейшего изучения склеродермического процесса.