Несмотря на очевидный прогресс в понимании биологии возникновения и прогрессирования злокачественных опухолей толстой кишки, а также значительное улучшение стратегий лечения, разработка новых терапевтических алгоритмов по-прежнему является необходимым условием для улучшения показателей выживаемости при этом заболевании [1, 2].
Традиционно доклиническую оценку противоопухолевой эффективности фармакологических субстанций выполняют с использованием хорошо зарекомендовавших себя клеточных линий, ксенотрансплантированных мышам с ослабленным иммунитетом (например, мышам Nude, SCID, NOG) [3].Ксенографты клеточных линий (CDX – cell-line derived xenograft) фенотипически и генетически достаточно однородны и не воспроизводят гетерогенность реальных опухолей; кроме того, раковые клетки вследствие отбора в условияхin vitro обычно имеют тенденцию к слабовыраженной дифференцировке и более агрессивные характеристики по сравнению с человеческими злокачественными новообразованиями. Хотя однородность клеточной культуры может быть весьма полезным фактором для решения ряда проблем фундаментальной науки, например для изучения сигнальных путей, CDX имеют ограниченный трансляционный потенциал [4]. Обнадеживающие результаты доклинических исследований противоопухолевой активности новых фармакологических субстанций, протестированных на ксенографтах культурального происхождения, в подавляющем большинстве случаев не воспроизводятся в ходе клинических испытаний, и вероятность того, что лекарственное средство будет одобрено и зарегистрировано среди онкологических препаратов, ниже, чем в других медицинских областях [5].
Потребность в более эффективных инструментах для проведения трансляционных исследований в области онкологии привела к разработке ксенографтов, полученных путем имплантации опухолевых образцов, взятых от пациента (PDX – patientderived xenograft) в ходе биопсии или хирургического этапа лечения, мышам с ослабленным иммунитетом.Этот подход позволяет учитывать исходные параметры злокачественных новообразований, генетическую и молекулярную гетерогенность, что является ключевыми чертами человеческих опухолей.Уникальный характер таких моделей позволяет с большой точностью воспроизвести морфологический и биологический спектр заболевания [6, 7].
Наиболее часто используемой процедурой для создания PDX является подкожная (гетеротопическая) имплантация опухолевого материала. Преимущества этого метода очевидны: не требуется наличие навыков экспериментальной хирургии у персонала, возможна оценка роста ксенографта без использования специальных приборов для визуализации. Однако подкожные ксенографты имеют и ряд недостатков, такие как низкая метастатическая способность, а также отсутствие взаимодействия опухоли с соответствующей микросредой, что, как известно, является важным элементом, влияющим на степень подвижности и инвазивности злокачественных клеток [4].
Ортотопические модели, полученные путем имплантации опухолевого материала в гистологически соответствующий орган, делают возможным изучение локальной опухолевой инвазии, а также метастатического распространения, тем самым исключаются недостатки подкожных ксенографтов.
Цель исследования
Целью работы явилось создание ортотопической PDX-модели рака толстой кишки путем имплантации опухолевых образцов, взятых от пациента, иммунодефицитным мышам линии Balb/c Nude.
Материал и методы исследования
Лабораторные животные и их содержание
Работу выполняли на 21 самке иммунодефицитных мышей линии Balb/c Nude, полученной из «SPF-вивария» Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск). Мыши содержались в SPF-блоке вивария федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» в индивидуально вентилируемых клетках в помещении с контролируемыми параметрами микроклимата (температура 18–26˚C, влажность воздуха 30–60%, световой режим «день – ночь» по 12 ч). Все манипуляции выполняли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием лабораторных животных».
Опухолевый материал
Для создания ортотопических PDX-моделей рака толстой кишки использовали образцы опухолей больных раком слепой кишки, полученные в результате хирургических резекций. От всех пациентов было взято письменное согласие на передачу биологического материала. Пациенты обратились в отделение абдоминальной онкологии № 1 «НМИЦ онкологии» в период с февраля 2020 г. по апрель 2020 г.
Создание ортотопической PDX-модели рака толстой кишки
Для создания 1-й генерации ортотопической PDX-модели рака толстой кишки применяли хирургический метод ортотопической имплантации – SOI (surgical orthotopic implantation). В ходе SOI выполняли имплантацию фрагмента опухоли пациента размером 2×2×2 мм в слепую кишку мышей линии Balb/c Nude. Последующие генерации ортотопической PDX-модели рака толстой кишки (2-ю и 3-ю генерации ксенографтов) получили путем последовательной серийной ортотопической трансплантации опухолевого материала методом SOI. Оценку приживления и роста ксенографта осуществляли, выполняя контрольную лапаротомию через 20, 50 и 70 дней после имплантации. Хирургические манипуляции выполняли с применением инъекционной анестезии для лабораторных животных, используя ветеринарные препараты «Ксила» и «Золелил-100» в дозах 20 мг/кг и 50 мг/кг соответственно. Эвтаназию производили методом дислокации шейных позвонков.
Анализ роста опухолевых ксенографтов
Измерения опухолевых узлов проводили в ходе лапаротомии при помощи штангенциркуля, их размеры рассчитывали по формуле Шрека для эллипсоида – V=а×в×с×p/6, где V – объем опухоли (мм3), а, в, с – максимальные диаметры эллипсоида в трех плоскостях (мм).
Гистологическое исследование
Опухолевые фрагменты фиксировали в 10%-ном формалине в течение 24 ч, затем заключали в парафин. После этого готовили гистологические срезы толщиной 2 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Проводили гистологическое исследование донорской и ксеногенных опухолей.
Статистический анализ
Полученные экспериментальные данные были обработаны статистически с помощью пакета программ STATISTICA 8.0. Данные об объемах ксенографтов представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего. Сравнение динамики роста между группами не выполнялось в связи с маленьким объемом выборки (n=3).
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе работ по созданию ортотопической PDX-модели рака толстой кишки, максимально точно воспроизводящей особенности человеческого заболевания, была выполнена серия экспериментов, предполагающих процедуру ортотопической имплантации опухолевого материала в слепую кишку иммунодефицитным мышам линии Balb/c Nude.
Для создания 1-й генерации ксенографтов было выполнено 5 процедур. В рамках одной процедуры опухолевый материал, взятый от 1 пациента, имплантировали группе, состоящей из 3 животных. Общие характеристики пациентов и оценка результатов соответствующей процедуры ксенотрансплантации представлены в таблице 1.
Таблица 1
Характеристики пациентов – доноров опухолевого материала и оценка результатов ксенотрансплантации иммунодефицитным мышам линии Balb/c Nude
Общие характеристики ортотопической ксенотрансплантации опухолевого материала от пациентов иммунодефицитным мышам |
|||||||
Характеристики пациентов – доноров опухолевого материала |
Оценка результатов имплантации (1-я генерация) |
||||||
Порядковый номер процедуры |
Пол пациента |
Способ получения образца |
Стадия TNM |
Гистология |
Предшествующее специализированное лечение |
Результаты имплантации общ. кол-во/кол-во приживления |
Объем ксенографтов через 50 дней после имплантации (мм3сутки, среднее значение)
|
1
|
Ж |
Удаление опухоли |
T3N0M0 |
Высокодифференцированная аденокарцинома |
– |
3/0 |
– |
2
|
Ж |
Удаление опухоли |
T3N1M0 |
Умеренно дифференцированная аденокарцинома |
– |
3/2 |
65 |
3
|
Ж |
Удаление опухоли |
T4N1M0 |
Умеренно дифференцированная аденокарцинома |
– |
3/3 |
104 |
4
|
Ж |
Удаление опухоли |
T3N1M0 |
Умеренно дифференцированная аденокарцинома |
– |
3/0 |
– |
5
|
Ж |
Удаление опухоли |
T3N1M0 |
Высокодифференцированная аденокарцинома |
– |
3/0 |
– |
Для достижения положительного результата ксенотрансплантации крайне важно избегать участков некроза и ориентироваться на зоны роста опухоли при выборе фрагмента донорского биоматериала. В связи с этим было принято решение не использовать биопсийные образцы. Все образцы, используемые для создания PDX, были выделены из макропрепаратов удаленных опухолей, полученных в результате выполнения хирургического этапа лечения. Опухолевый материал тщательно промывали питательной средой RPMI1640 c содержанием гентамицина 10%, удаляли некротические ткани, затем делили на фрагменты размером около 2×2×2 мм для имплантации в купол слепой кишки животных-реципиентов разработанным нами способом (рис. 1) [8].
Рис. 1. Создание ортотопической PDX-модели имплантацией фрагмента опухоли толстой кишки человека в слепую кишку иммунодефицитных мышей. А – наложение кисетного серозно-мышечного шва в концевой части слепой кишки мыши; Б – рассечение серозно-мышечного слоя в концевой части слепой кишки; В – инвагинация концевой части слепой кишки и имплантация фрагмента опухоли толстой кишки человека в образовавшийся «карман»; Г – фиксация фрагмента опухоли путем затягивания кисетного шва на слепой кишке мыши
Две из пяти выполненных процедур привели к положительному результату в виде формирования ортотопических ксенографтов (рис. 2).
Рис. 2. Мышь линии Balb/c Nude с ортотопическим ксенографтом рака толстой кишки человека
Биоматериал пациента (фрагмент донорской опухоли) и ортотопические ксенографты последовательных трех генераций были охарактеризованы как умеренно дифференцированные аденокарциномы с очагами десмопластической реакции (рис. 3). Степень дифференцировки оставалась стабильной и не менялась от предыдущей генерации ксенографта к последующим. Эти наблюдения подтверждают наличие выраженного сходства между донорской и ксенотрансплантированными опухолями ранних генераций (1-я, 2-я и 3-я генерация).
Рис. 3. Гистологические препараты рака толстой кишки. А – опухоль пациента (донорская опухоль). Окраска гематоксилином и эозином. ×200; Б – ксеногенная опухоль, 1-я генерация; В – ксеногенная опухоль, 2-я генерация; Г – ксеногенная опухоль, 3-я генерация
Контрольная лапаротомия, выполненная через 20, 50 и 70 дней, показала отсутствие положительного результата процедур имплантации № 1, № 4 и № 5; в результате процедуры № 2 наблюдался рост ксенографтов у двух из трех животных в группе, однако динамика увеличения объемов опухолевых узлов была незначительной (менее 100 мм3 через 70 дней после имплантации), в связи с этим животные были подвергнуты эвтаназии, а опухолевый материал был выделен и заморожен для дальнейшего изучения.
При лапаротомии, выполненной через 20 дней, в результате процедуры имплантации № 3 у всех мышей в группе наблюдался рост первичной опухоли, средний размер ксенографтов составил 47,6 мм3. Средние объемы ксенографтов через 50 и 70 дней после имплантации составили 104,1 мм3 и 157,0 мм3 соответственно.
2-я и 3-я генерации PDX, полученные путем последовательной серийной ортотопической трансплантации опухолевого материала, характеризовались более высокими темпами роста. Средние объемы ксенографтов 2-й генерации составили 67,9 мм3, 117,1 мм3 и 370,0 мм3 через 20, 50 и 70 дней после имплантации соответственно; средние объемы ксенографтов 3-й генерации составили 67,2 мм3,155,4 мм3 и 330,0 мм3 через 20, 50 и 70 дней после имплантации соответственно.
Рис. 4. Средние объемы ортотопических ксенографтов рака толстой кишки человека трех последовательных генераций через 20, 50 и 70 дней после имплантации опухолевого фрагмента иммунодефицитным мышам линии Balb/c Nude (процедура имплантации № 3)
Данные представлены в виде среднего значения, в качестве планки погрешности указана стандартная ошибка среднего.
Представленные результаты позволяют говорить о том, что стратегия последовательной ортотопической имплантации фрагментов опухолевого материала (создание 2-й и 3-й генераций PDX) позволяет добиться устойчивых трансплантационных и динамических характеристик, а отсутствие дезагрегации клеток для введения в соответствующий орган мыши, как это описано в ряде работ [9, 10, 11], способствует сохранению исходной структуры опухолевой ткани человека, что может иметь большое значение для определения биологического поведения опухоли.
Заключение
Для создания ортотопической PDX-модели образцы рака толстой кишки человека, полученные хирургическим путем у пациентов, были имплантированы ортотопически в слепую кишку мышей линии Balb/c Nude, при этом наблюдался обширный ортотопический рост у 3 из 15 животных при создании 1-й генерации ксенографтов рака толстой кишки человека. Полученная модель демонстрировала локальный рост, устойчивые характеристики приживления, а также воспроизводила гистологию донорской опухоли, что указывает на возможность ее применения для in vivo тестирования фармакологических субстанций, обладающих потенциальным противоопухолевым эффектом в отношении рака толстой кишки человека.