Ревматоидный артрит (РА) - хроническое аутоиммунное заболевание, характеризующееся прогрессирующим симметричным воспалением пораженных суставов, приводящим к разрушению хряща, эрозии костей и инвалидности. В зависимости от пола распространенность заболевания колеблется от 0,4% до 1,3% населения [1]. Напрямую к летальному исходу РА не приводит, но значительно снижает качество и продолжительность жизни пациентов.

РА характеризуется нарушениями врожденного иммунитета, включая опосредованную иммунным комплексом активацию комплемента, а также адаптивными иммунными ответами против «собственных» антигенов, содержащих преимущественно посттрансляционно модифицированные белки, нарушение регуляции цитокиновых сетей, активацию остеокластов, хондроцитов и импринтинг резидентных стромальных клеток, которые, в свою очередь, поддерживают прогрессирование заболевания [2]. Об участии в развитии РА нарушений регуляции иммунной системы стало известно еще в 40-х годах прошлого столетия после открытия E. Waaler и H.M. Rose антител против иммуноглобулина G, известных как ревматоидные факторы. Однако за последние 50 лет концепция участия иммунного ответа в патогенезе РА получила интенсивное развитие и претерпела значительную модификацию. В настоящее время считается, что в патогенезе ревматоидного процесса доминирует аутореактивность. Хотя и другие механизмы вносят определенный вклад в патогенез заболевания.

РА тесно связан с различными иммунными клетками, и каждый тип клеток по-разному влияет на патогенез заболевания, при этом решающую роль в инициации и хронизации РА в основном играют Т- и В-лимфоциты и макрофаги. Эти клетки могут находиться либо в синовиальной оболочке, либо циркулировать в периферической крови. Активация иммунокомпетентных клеток сопровождается продукцией различных клеточных медиаторов, в том числе и цитокинов, а также антител, образующих с антигеном иммунные комплексы (ревматоидный фактор, антитела к цитруллинированным белкам). На ранних этапах патогенеза РА преобладающими цитокинами являются IL-13, IL-14 и IL-15, секретируемые Т-клетками и стромальными клетками. Иммуновоспалительные клетки, а также иммунные комплексы, циркулирующие в кровеносном русле, оседают и накапливаются в синовиальных тканях, что сопровождается воспалительной реакцией и приводит к прогрессирующему разрушению хрящей и костей. Считается, что поддержание этого воспалительного процесса опосредуется рядом цитокинов: TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23 и IFN-γ [1; 3].

Доказано, что в модулировании врожденного и адаптивного иммунного ответа центральную роль играют активные формы кислорода и активные формы азота. Влияние активных форм кислорода на иммунные процессы осуществляется, прежде всего, на начальных этапах Т-клеточного иммунного ответа. Кроме того, активированные макрофаги и лимфоциты в синовиальной оболочке через секрецию цитокинов индуцируют продукцию активных форм кислорода, которые влияют на пролиферацию, дифференциацию Т-клеток и определяют фенотип последних [4].

Более того, накапливающиеся в синовиальных тканях в высоких концентрациях цитокины активируют и вовлекают в воспалительный процесс нейтрофилы и макрофаги, которые, образуя внеклеточные ловушки (NETs и ETs, соответственно) в результате особых процессов гибели клеток (NETos и ETos, соответственно), способствуют дальнейшей генерации свободных радикалов и возникновению окислительного стресса [4].

В последние годы этим процессам придается особое значение в нарушении иммунологической толерантности и поддержании аутоиммунного воспаления при РА. Основывается это на том, что один из компонентов NETs - цитоплазматические и внеклеточные цитруллинированные антигены, связываясь антицитрулинированными антителами, формируют иммунные комплексы, которые являются индукторами дальнейшего NETos при РА [1].

Активация фагоцитарных клеток (нейтрофилов и макрофагов) и образование ими внеклеточных ловушек опосредуется никотинамидадениндинуклеотидфосфат оксидазой (НАДФН-оксидазой), катализирующей восстановление молекулярного кислорода до супероксид-радикала, что сопровождается значительным увеличением потребления кислорода и, как следствие, продукцией супероксид-анионов O2 • -. Активация НАДФН-оксидазы может быть вызвана цитокинами, такими как интерферон, интерлейкины и фактор некроза опухоли-α. Помимо активных форм кислорода, химически активные формы азота, такие как пероксинитритный радикал ONOO‐, образующийся в результате реакции между O2 • - и оксидом азота, также могут вызывать окислительное повреждение [5].

Относительно недавно было установлено, что НАДФ-оксидаза посредством активных форм кислорода контролирует уникальную ферментную систему – ксантиноксидоредуктазу (КОР; ЕС 1.17.3.2), стимулируя переход дегидрогеназной формы фермента – ксантиндегидрогеназы (КДГ; Е.С. 1.17.1.4) в оксидазную – ксантиоксидазу (КО; Е.С. 1.17.3.2) [6]. Несмотря на то что энзим был открыт в 1902 г. Schardinger, интерес ученых к нему не ослабевает и в настоящее время. Хорошо известно, что КОР является прооксидантным ферментом, участвующим в метаболизме пуринов, катализируя превращение гипоксантина и ксантина в мочевую кислоту. В ходе этой реакции образуются активные формы кислорода и активные формы азота, которые могут вызывать окислительный стресс, в том числе после гипоксии/реоксигенации и ишемии/реперфузии – процессов, наблюдаемых при РА [7]. Результаты научных исследований свидетельствуют, что и НАДФ-оксидаза, и КОР активируются свободными радикалами, что дает основание сделать предположение о последовательном функционировании обоих ферментов. Однако роль КОР в патогенезе РА остается недостаточно изученной. Ранее в своих работах мы изучали активность КОР в плазме. Несомненный интерес представляет исследование активности фермента в лимфоцитах - иммунокомпетентных клетках, принимающих непосредственное участие в патогенезе РА.

Цель исследования – описание профиля активности ксантиноксидазы (КО), ксантиндегидрогеназы (КДГ) в лизатах лимфоцитов больных РА в зависимости от степени активности заболевания.

Материал и методы исследования

Работа получила одобрение этического комитета ФГБНУ «НИИ клинической и экспериментальной ревматологии имени А.Б. Зборовского». В исследование вошли больные ревматологического отделения ГУЗ «ГКБСМП № 25» г. Волгограда, составившие основную группу, а также доноры станции переливания крови, образовавшие контрольную группу. Диагноз РА был верифицирован согласно критериям, разработанным и утвержденным ACR/EULAR 2010. Оценка активности ревматоидного процесса проводилась на основании индекса Disease Activity Score (DAS28). Активность заболевания расценивалась как низкая (DAS28 ≤ 3,2), умеренная (3,2 > DAS28 ≤ 5,1) или высокая (DAS28 > 5,1). Демографические параметры обеих групп и клинические параметры больных РА представлены в таблице 1. Обе группы были сопоставимы по полу и возрасту.

Таблица 1

Демографические и клинические параметры контрольной и основной групп

Энзимные исследования проводились в лизатах лимфоцитов, источником которых служила венозная кровь, получаемая чаще всего из локтевой вены пациентов в утренние часы до приема пищи. Выделение лимфоцитов проводили по методу А. Böyum с использованием лимфосепа (фирма JCN Biomedicals) с плотностью 1,077-1,079 г/мл [8]. Жизнеспособность последних оценивали общепринятым методом, окрашивая лимфоциты в 0,2% растворе трипанового синего. Подсчет живых лимфоцитов проводился под микроскопом в камере Горяева по общепринятой методике. Лизаты клеток получали путем смешивания суспензии лимфоцитов с 1% раствором тритона Х-100 с последующим трехкратным процессом замораживания-оттаивания. Активность ферментов определяли спектрофотометрическим методом: КО – при длине волны 293 нм, КДГ – 340 нм, и выражали в нмоль/мин/мл в пересчете на 107 лимфоцитов в 1 мл [9].

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программного пакета Statistica 6.0. Для сравнения групп использовали U-test Mann–Whitney. Данные, полученные в ходе статистического анализа, отображали в виде медианы и квартилей: Ме, Q25, Q75. Взаимосвязь признаков описывали с применением рангового коэффициента корреляции Спирмена (r). Достоверными различия считались при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Референтный размах (95-процентильный интервал) для КО – 14,11-31,33 нмоль/мин/мл; для КДГ – 18,62-39,64 нмоль/мин/мл.

Активность КО и КДГ в референтной группе не имела зависимости от демографических параметров (пол и возраст). Поэтому эти параметры не принимались во внимание при изучении активности ферментов в основной группе.

Активность ферментов энзимного комплекса КОР у больных РА, как в группе в целом, так и при всех трех степенях активности воспалительного процесса, была значительно ниже по сравнению с контрольной группой. При этом чем выше была активность ревматоидного воспаления, тем больше снижалась активность обеих форм КОР. Результаты анализа отражены в таблице 2.

Таблица 2

Показатели активности КО и КДГ в лимфоцитах больных РА в зависимости от степени активности воспалительного процесса (Me(Q25; Q75))

Анализ зависимости активности КО и КДГ от индекса DAS28 выявил наличие обратных корреляционных связей высокой степени (табл. 3).

Таблица 3

Зависимость активности КО и КДГ лимфоцитов больных РА от индекса активности DAS28

Проведенные исследования в лизатах лимфоцитов демонстрируют однонаправленные изменения активности обеих форм КОР, заключающиеся в снижении как активности КО, так и КДГ. При этом показатели энзимной активности коррелировали с активностью ревматоидного процесса. Снижение активности ферментов прооксидантного энзимного комплекса в лимфоцитах можно объяснить повышением уровня ферментов в крови в результате увеличения проницаемости клеточных мембран при воспалении и выходом энзимов в периферическое кровеносное русло, что подтверждается увеличением активности КО в плазме крови, продемонстрированном в наших предыдущих исследованиях [10]. Однако повышение содержания энзимов в плазме возможно не только за счет увеличения клеточной проницаемости лимфоцитов, но и за счет перехода ферментов в кровь из органов и тканей, вовлеченных в воспалительный процесс. Долевой уровень ферментов в плазме, обусловленный выходом энзимов из лимфоцитов и органов, требует дополнительного анализа и имеет определенные перспективы для диагностики повреждения органов при РА и выяснения некоторых патогенетических аспектов заболевания.

Увеличение активности оксидазной формы КОР в плазме крови параллельно с уменьшением ее активности в лимфоцитах может свидетельствовать об усилении свободнорадикального окисления и чрезмерной генерации АФК при РА, а снижение активности дегидрогеназной формы КОР говорит о переходе КДГ в КО. Прогрессирующая трансформация КОР, наблюдаемая с ростом активности РА, вероятно, служит доказательством поддержания окислительного стресса и прогрессирования воспалительного процесса в суставе, который приводит к разрастанию синовиальной оболочки, образованию «паннуса», деградации хряща и костной эрозии [1]. Кроме того, полученные данные дают возможность предположить запуск образования внеклеточных ловушек нейтрофилами и моноцитами на фоне активации продукции свободных радикалов.

Выводы

1. Энзимный профиль лимфоцитов периферической крови при РА отличается снижением активности обеих форм КОР: КО и КДГ. Увеличение степени активности сопровождается прогрессирующим снижением активности КО и КДГ.

2. Прогрессирование степени активности ревматоидного воспаления сопровождается усугублением свободнорадикального окисления и ростом напряженности оксидантного статуса.