Лечение сахарного диабета 1-го (СД1) и 2-го типа (СД2) сопровождается значительными колебаниями уровня глюкозы в крови. Причинами гипергликемии при сахарном диабете являются снижение потребления глюкозы мышечной и жировой тканями и стимуляция глюконеогенеза, преимущественно в печени. В то же время частым осложнением терапии сахарного диабета является гипогликемия. Гипогликемия приводит к дефициту глюкозы в головном мозге, коме и в конечном итоге к смерти. Пациенты с СД1 испытывают в среднем два эпизода симптоматической гипогликемии каждую неделю, т.е. имеет место возобновляющаяся гипогликемия. До 10% больных СД1 умирают от ятрогенной гипогликемии. Гипогликемия служит «фактором, ограничивающим терапию диабета» [1].

Печень является органом, обеспечивающим поддержание адекватного уровня гликемии. Основными процессами, приводящими к увеличению содержания глюкозы в крови, служат мобилизация гликогена печени и глюконеогенез. Гипогликемия и глюкагон стимулируют, а инсулин угнетает эти процессы [2]. Следовательно, инсулиновая гипогликемия оказывает разнонаправленное воздействие на метаболизм печени.

Целью исследования является оценка нарушений метаболизма в печени в условиях инсулиновой гипогликемии при сахарном диабете и роли инсулиновой гипогликемии в развитии осложнений сахарного диабета.

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на 30 белых крысах-самцах массой 220–250 г. Животные были разделены на 4 группы: 1-я группа – интактные животные (контроль); 2-я группа (состояние, обозначаемое как гипогликемия, ГГ) – животные, обследованные через 3,5–4,0 часа после введения инсулина (частичная утрата постуральных рефлексов, уровень глюкозы в крови 1,5–2,0 ммоль/л); 3-я группа – крысы с аллоксановым сахарным диабетом (СД) (125 мг аллоксана внутрибрюшинно однократно на 15-е сутки после введения аллоксана, уровень глюкозы в крови натощак 8–13 ммоль/л); 4-я группа – животные с СД в состоянии ГГ. Инсулин вводили внутримышечно в дозе 40 ЕД на 1 кг массы тела. Перед забоем животные были лишены пищи в течение 18–20 часов, воду получали без ограничения во всех условиях эксперимента.

В крови экспериментальных животных определяли содержание глюкозы, лактата, свободных жирных кислот (СЖК), мочевины и мочевой кислоты, а в печени – количество гликогена современными энзиматическими и колориметрическими методами, используемыми в клинической биохимии.

В печени экспериментальных животных определяли активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД, КФ 1.1.1.49), лактатдегидрогеназы (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), глутаминазы (КФ 3.5.1.2) и аденозинмонофосфатдезаминазы (АМФД, КФ 3.5.4.6) и глюкозо-6-фосфатазы (Г6Ф-аза, КФ 3.1.3.9). Все использованные методы определения активности ферментов и содержания субстратов являются общепринятыми, широко апробированными и описаны ранее. Активности Г6ФД и ЛДГ определяли по скорости образования восстановленных форм соответственно НАДФ и НАД спектрофотометрически, активности глутаминазы и АМФД – по скорости продукции аммиака [3]. Активность Г6Ф-азы определяли по скорости накопления неорганического фосфата [4]. Интенсивность гликогенолиза и гликолиза оценивали по скорости образования лактата при использовании в качестве субстратов гликогена и глюкозо-6-фосфата; при этом количество лактата определяли энзиматически [3]. Конечные измерения во всех случаях производили на фотометре КФК-3 отечественного производства. Статистическую достоверность различий между результатами, полученными при обследовании различных групп, оценивали по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

У животных 2-й группы через 3,5–4,0 часа после введения инсулина в крови снижается уровень глюкозы до 1,5–2,0 ммоль/л (табл. 1); по сравнению с контролем концентрация лактата уменьшается на 35%, СЖК – на 36%, мочевины – в 2,8 раза, мочевой кислоты – на 30%, содержание гликогена в печени снижается в 7,0 раз (во всех случаях p<0,01).

Таблица 1

Содержание метаболитов в крови и гликогена в печени крыс с СД при инсулиновой гипогликемии (M±m)

Примечание. В таблицах 1 и 2: M – среднее, m – ошибка среднего; n – число животных в группе; статистически достоверные по сравнению с контролем изменения обозначены: * – p<0,05, ** – p<0,01, *** – p<0,001; статистически достоверные различия между экспериментальными животными 3-й и 4-й групп обозначены: †– p<0,05, †† – p<0,01, ††† – p<0,001.

У животных с СД (3-я группа) по сравнению с контролем содержание мочевины в крови увеличивается в 2,1 раза (p<0,05), а гликогена в печени – в 4 раза (p<0,001). Концентрация глюкозы в крови у крыс 4-й группы составляет 2,0–2,5 ммоль/л, при этом содержание гликогена в печени снижается в 6,0 раз по сравнению с величиной этого показателя у крыс 3-й группы (СД), но в 5 раз превышает уровень гликогена у крыс 2-й группы (во всех случаях p<0,001). У животных 4-й группы по сравнению с контролем происходит значительный рост уровня мочевины в крови; этот показатель в 3,7 раза выше, чем в контрольной группе (p<0,001), и в 1,7 раза выше, чем у крыс 3-й группы (p<0,05).

Активность Г6ФД по сравнению с контролем у животных 2-й группы увеличивается в 2,1 раза, а у животных 3-й и 4-й групп снижается соответственно на 56% и 38% по сравнению с контролем (во всех случаях p<0,001) (табл. 2).

Таблица 2

Активность ферментов углеводного и азотистого обмена в печени крыс с СД при инсулиновой гипогликемии (M±m)

У животных 4-й группы активность Г6ФД на 42% (p<0,001) выше, чем у крыс 3-й группы. Скорость образования лактата при использовании в качестве субстратов глюкозо-6-фосфата и гликогена по сравнению с контролем у крыс 2-й группы снижается соответственно на 18% и 45% (в обоих случаях p<0,01) и увеличивается у животных 4-й группы соответственно на 33% и 30% (в обоих случаях p<0,01). Существенных изменений активности Г6Ф-азы у крыс 2-й, 3-й и 4-й экспериментальных групп не выявлено. У животных 4-й группы по сравнению с крысами 1-й и 3-й групп уменьшается активность ЛДГ на 38–39% (p<0,01). Активность АМФД у крыс 4-й группы увеличивается почти в 2 раза как по сравнению с контролем, так и по сравнению с 3-й группой (в обоих случаях p<0,01). Активность глутаминазы у животных 3-й и 4-й групп была выше, чем в контрольной группе, соответственно на 55% и 66% (в обоих случаях p<0,001).

В физиологических условиях инсулин выделяется в ответ на увеличение количества глюкозы в крови; в ходе наших экспериментов гиперинсулинемия имеет место в условиях низкой гликемии. Гомеостаз глюкозы в организме обеспечивается, в основном, печенью. Влияние инсулиновой гипогликемии на метаболизм в печени включает в себя воздействие инсулина непосредственно на гепатоциты, а также внепеченочные эффекты гормона, в частности торможение липолиза в жировой ткани и угнетение секреции глюкагона. Функция глюкагона состоит в обеспечении быстрого увеличения продукции глюкозы печенью при гипогликемии путем стимуляции мобилизации гликогена и активации глюконеогенеза [2].

Активность Г6ФД у крыс 2-й группы значительно увеличивается, у животных с СД снижается, и после введения инсулина животным с аллоксановым диабетом наблюдается увеличение активности фермента (табл. 2). Повышение экспрессии Г6ФД происходит при активации пути PI3K – Akt – mTORC1 – SREBP [5]. Поскольку метаболические эффекты инсулина также проявляются по этому пути [2], вероятной причиной изменений активности Г6ФД в печени животных в условиях данного эксперимента являются инсулиновые эффекты. По-видимому, увеличение активности Г6ФД после введения инсулина животным с СД свидетельствует о сохранении у них передачи инсулинового сигнала по пути PI3K – Akt – mTORC1 – SREBP.

Активность глутаминазы увеличивается у крыс с СД и остается высокой при индукции инсулиновой гипогликемии у этих животных. Глутамин является основной транспортной формой аммиака в печень, причем углеродный скелет глутамина используется в глюконеогенезе [6]. Первую реакцию превращения глутамина в печени катализирует глутаминаза, потребление глутамина печенью и активность глутаминазы при сахарном диабете значительно увеличиваются [6, 7]. Поэтому повышение дезамидирования глутамина у пациентов с СД, имеющих печеночную недостаточность, рассматривается как фактор, способствующий развитию печеночной энцефалопатии [7].

У животных с СД уровень мочевины в крови увеличен; при гипогликемии у крыс с СД наблюдаются даже более значительные изменения этого показателя, что свидетельствует о резком усилении уреагенеза в печени. Глюкагон по пути cAMP – PKA – CREB увеличивает синтез ферментов орнитинового цикла на уровне транскрипции [8]. Поэтому можно предполагать, что увеличение продукции мочевины у крыс с СД связано с действием глюкагона и активацией протеинкиназы А (РКА). Однако быстрое увеличение образования мочевины при инсулиновой гипогликемии у крыс с СД не может быть объяснено изменениями синтеза белков-ферментов. Вероятно, имеет место увеличение активности уже существующих ферментов и переносчиков аминокислот. Это может происходить путем ацетилирования, деацетилирования и фосфорилирования [8]. В частности, под действием глюкагона происходит резкое увеличение активности N-ацетилглутаматсинтетазы и концентрации N-ацетилглутамата – обязательного аллостерического активатора карбамоилфосфатсинтетазы 1. Увеличение содержания N-ацетилглутамата позволяет быстро активировать карбамоилфосфатсинтетазу 1 и образование мочевины в течение нескольких минут [8]. Снижение уровня мочевины в крови крыс 2-й группы вызвано, по-видимому, угнетением инсулином выделения глюкагона [2, 9] у этих животных.

Таким образом, в условиях проведенного эксперимента у животных с СД в состоянии инсулиновой гипогликемии обнаруживаются типичные глюкагоновые эффекты, связанные с резким усилением глюконеогенеза из аминокислот. Быстрый и прямой отрицательный контроль глюконеогенеза с помощью инсулина in vivo не проявляется [9]. Изменений активности Г6Фазы в условиях настоящего эксперимента не выявлено, однако активность фермента не обязательно лимитирует продукцию глюкозы печенью [9].

Увеличение активности АМФД у животных с СД при инсулиновой гипогликемии также свидетельствует об увеличении непрямого дезаминирования аминокислот в цикле пуриновых нуклеотидов; следствием активации цикла является дополнительное образование аммиака (а затем и мочевины) и исходных продуктов для глюконеогенеза [3].

Однако увеличение активности АМФД может приводить к снижению уровня АМФ и к увеличению образования мочевой кислоты. Повышение активности АМФД в печени крыс с СД в состоянии гипогликемии (4-я экспериментальная группа) сопровождается увеличением содержания мочевой кислоты в крови (табл. 1). Снижение уровня АМФ и рост уровня мочевой кислоты в гепатоцитах приводят к уменьшению активности АМФ-активируемой протеинкиназы (AMPK) [10]. Снижение активности AMPK вызывает уменьшение фосфорилирования mTORC2 по остаткам Ser171, нефосфорилированный по Ser171 TORC2 поступает в ядро и стимулирует транскрипцию генов ключевых ферментов глюконеогенеза – фосфоенолпируваткарбоксикиназы и глюкозо-6-фосфатазы [10]. AMФД активируется в печени животных с диабетом, что коррелирует со значительным снижением активности AMPK и значительным увеличением продукции глюкозы в ходе глюконеогенеза [10]. В настоящем исследовании увеличение активности АМФД при гипогликемии наблюдалось только у крыс с СД, но не при гипогликемии у животных 2-й группы. Увеличение активности фермента у животных 4-й группы может быть связано с действием глюкагона [11]. Необходимо также отметить, что увеличение образования мочевой кислоты имеет самостоятельное значение в патогенезе СД и его осложнений, таких как атеросклероз, микроангиопатии и нейропатии [12]. Таким образом, частые эпизоды гипогликемии являются фактором, способствующим развитию отдаленных осложнений заболевания.

Содержание СЖК и лактата уменьшается при инсулиновой гипогликемии у животных 2-й группы (табл. 1). Инсулин угнетает липолиз в жировой ткани и гликогенолиз в скелетных мышцах [2]. Снижение липолиза является основным механизмом подавления глюконеогенеза в печени под действием инсулина, поскольку основным источником АТФ и восстановительных эквивалентов для глюконеогенеза служит окисление жирных кислот [2, 9]. Подавление инсулином продукции глюкозы печенью связано со снижением липолиза в адипоцитах и падением уровня сывороточных СЖК и не зависит от изменений тонуса блуждающего нерва и действия глюкагона [2, 9]. Инсулиновая гипогликемия у крыс с СД, в отличие от гипогликемии у животных 2-й группы, не приводит к уменьшению уровня СЖК (табл. 1). Таким образом, глюконеогенез в печени при гипогликемии у крыс с СД, по-видимому, не лимитирован окислением жирных кислот.

При гипогликемии уровень гликогена в печени уменьшается как у животных 2-й группы, так и у крыс с СД. Вместе с тем уровень гликогена в печени крыс с СД при гипогликемии значительно выше (табл. 1). Высокий уровень гликогена в печени при гипогликемии у животных 4-й группы, вероятно, не связан с нарушениями мобилизации гликогена, а обусловлен увеличением количества гранул гликогена [13] и значительным увеличением интенсивности глюконеогенеза. В условиях активации глюконеогенеза для поддержания уровня глюкозы в крови параллельно происходит и образование гликогена в печени, поскольку до половины глюкозо-6-фосфата, образованного в ходе глюконеогенеза, сначала включается в гликоген, а затем осуществляется мобилизация гликогена [6, 7].

Скорость образования лактата при использовании в качестве субстратов гликогена и глюкозо-6-фосфата при гипогликемии у животных 2-й группы уменьшается, а при гипогликемии у крыс с СД – увеличивается (табл. 2). Глюкагон угнетает гликолиз и стимулирует глюконеогенез в острых условиях, увеличивая активность протеинкиназы А (PKA) [8, 9]. Однако активация глюконеогенеза как процесса приводит к увеличению уровня АМФ и активации АМФ-зависимой протеинкиназы (АМРК) [14]. Кроме того, под действием глюкагона активность АМРК также увеличивается [11]. АМРК активирует гликолиз [11]. Таким образом, глюкагон обладает «двойственным» воздействием на скорость дихотомического распада углеводов в печени.

По-видимому, при гипогликемии у крыс с СД в отношении гликолиза преобладают эффекты гормона, реализуемые через АМРК [14]. Необходимо отметить, что одновременная стимуляция гликолиза и глюконеогенеза приведет к активации большого футильного цикла и к еще большему увеличению продукции АМФ. Увеличение уровня АМФ и/или активация АМРК могут явиться причинами увеличения активности АМФД, обнаруженной в данном эксперименте, тем более что АМФД рассматриваются как регулятор активности АМРК [10].

Увеличение скорости накопления лактата при использовании в качестве субстратов глюкозо-6-фосфата и гликогена при гипогликемии у животных с СД в условиях острого опыта указывает на изменение активности уже существующих ферментов гликолиза [11, 14], однако активность ЛДГ у этих животных значительно уменьшается. Поскольку ЛДГ выполняет множество функций, наиболее вероятной причиной существенного снижения активности ЛДГ является уменьшение количества белка-фермента. Это может быть связано с перемещением ЛДГ в ядро или с образованием комплекса с другими белками; особенно интригующими в контексте настоящего обсуждения являются возможное связывание ЛДГ с АМРК и участие в регуляции ее активности [15].

Заключение

Инсулиновая гипогликемия у крыс с аллоксановым диабетом приводит к увеличению активности глутаминазы и аденозинмонофосфатдезаминазы в печени, к резкому увеличению уровня мочевины и мочевой кислоты в крови; в печени увеличивается интенсивность гликолиза и снижается активность лактатдегидрогеназы. Выявленные изменения отражают активацию глюконеогенеза из аминокислот и могут быть связаны с действием глюкагона и увеличением активности АМФ-зависимой протеинкиназы. В условиях возобновляющейся гипогликемии у пациентов с сахарным диабетом такие изменения будут способствовать развитию отрицательного азотистого баланса и увеличению продукции мочевой кислоты.