Известно, что липиды включают жирные кислоты, кетоновые тела, триацилглицерины, фосфолипиды и сфинголипиды, эйкозаноиды, холестерин, соли желчных кислот, стероидные гормоны и жирорастворимые витамины, которые играют самые разные роли в биологии человека. Основным стероидом является холестерин, входящий в состав бислойных мембран клеток, а также используется в биосинтезе стероидных гормонов, витамина D, желчных кислот и солей. При окислении холестерина образуются оксистерины, являющиеся регуляторными факторами обмена холестерина [1].

Процесс внутри- и внеклеточного транспорта холестерина, оксистеринов и фосфолипидов обеспечивается белками-переносчиками. Так, внутри клетки этот процесс реализуется при помощи оксистерин-связывающих белков (oxysterol-binding proteins, OSBP) и OSBP-связанных белков (OSBP-related proteins, ORP), тогда как внеклеточный транспорт обеспечивается процессом ферментативного сульфатирования члена 1 семейства 2B сульфотрансфераз (sulfotransferase Family 2B member 1, SULT2B1) или активной экскрецией белками-транспортерами АТФ-связывающих кассет (ATP-binding cassette, ABC) [2; 3].

Другим регулятором окисления жирных кислот в печени является a-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом (peroxisome proliferator-activated receptor a, PPAR- a).

До настоящего времени вопрос о группе генов, которые регулируют PPAR- a, а также активируются этим рецептором, до конца не изучен. Среди этих генов ACACA, FAS, SREBP1, FADS1, DGAT1, ABCA1, PLTP, ABCB4, UGT2B4, SULT2A1, Pnpla2, Acsl1, Slc27a4, многие гены Acot и другие [4; 5].

Установлено, что в геноме человека имеются около 50 генов, которые кодируют суперсемейство АТФ-связывающих молекул (ATP-binding cassette, ABC), включая 7 подсемейств от ABCA до ABCG. В 1-ю группу включены семь генов в шести хромосомах, ABCA1 (9q22-q31), ABCA2 (9q34), ABCA3 (16p13,3), ABCA4 (1p22), ABCA7 (19p13,3), ABCA11 (4p16), ABCA12 (2q35), а во 2-ю – пять генов (ABCA5, ABCA6, ABCA8, ABCA9 и ABCA10) в кластере на хромосоме 17q24 [6].

Имеются данные о том, что мутации в генах, кодирующих АВС-транспортеры, определяют развитие ряда болезней человека. Так, выявлено, что одни мутации в гене ABCA1 связаны с болезнью Танжера, другие – увеличивают риск инфаркта миокарда, развития атеросклероза, семейной гиперхолестеринемии, а также увеличивают частоту системных и местных воспалительных реакций [7; 8]. Мутации в генах ABCG, ABCG5 и ABCG8 вызывают ситостеролемию. Также было установлено, что на уровень липидов в плазме крови оказывают влияние 5 полиморфизмов в генах ABCG5 и ABCG8 [9; 10].

Известно, что патогенез акне многофакторный и включает повышенную активацию сально-волосяных фолликулов (СВФ) под воздействием гиперандрогении, гиперсекрецию себума и патологическую фолликулярную кератинизацию, а также формирование воспалительной реакции. Установлено, что избыточная продукция кожного сала сопровождается изменением его липидного состава, в частности уменьшением количества незаменимых жирных кислот, включая линоленовую кислоту, и дисбалансом антиоксидантных свойств [11].

С учетом участия липидов в патогенезе акне актуальным является изучение механизмов внутри- и внеклеточного метаболизма липидов и их транспорта для обеспечения кислородного метаболизма клетки, включая определение патогенетической роли регуляторных генетических факторов.

Целью настоящего исследования было определение и анализ вариантов нуклеотидной последовательности генов АТФ-связывающих белков кислородного метаболизма ABCA1, ABCB7, ABCC8, ABCG5, ABCG8 у пациентов с тяжелой формой акне.

Материалы и методы исследования

Для достижения поставленной цели в 2017-2020 гг. проведено проспективное открытое нерандомизированное одноцентровое исследование.

Участники исследования. Под нашим наблюдением в клинических условиях на кафедре кожных болезней и косметологии ФДПО ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И.Пирогова» МЗ РФ находились 50 пациентов основной группы и 20 участников группы сравнения (всего 70 человек) в возрасте от 15 до 46 лет (медиана – 22,1 года). Размер выборки предварительно не рассчитывался. Исследование выполнено с информированного согласия всех пациентов, включенных в исследование, и одобрено этическим комитетом ФГАОУ ВО «РНИМУ» МЗ РФ в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинский исследований с участием человека» с поправками 2008 г., протоколом Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г., и в соответствии со статьями 20, 22, 23 Федерального закона «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21 ноября 2011 г. № 323-ФЗ (ред. от 21.07.2014).

В основную группу были включены 50 пациентов (29 мужчин и 21 женщина) с тяжелой формой акне. Возраст на момент исследования варьировал от 15 до 46 лет (медиана – 23,2 года). Группу сравнения составили 20 условно здоровых лиц (13 мужчин и 7 женщин) от 16 до 40 лет (медиана – 19,4 года). Таким образом, основная группа и группа сравнения были сопоставимы по половозрастным характеристикам (p>0,05).

Молекулярно-генетическая диагностика. Молекулярно-генетическая диагностика была проведена всем 50 пациентам основной и 20 условно здоровым лицам группы сравнения методом высокопроизводительного секвенирования ДНК – секвенирование «нового поколения» (next-generation sequencing, NGS) в лаборатории молекулярной биологии ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дм. Рогачева» МЗ РФ. Геномная ДНК была выделена из образцов цельной крови обследованных больных с использованием набора CellSep Advanced Kit. (DiaSorin Ireland Ltd., Ирландия) согласно инструкции производителя.

Для оценки популяционных частот выявленных вариантов использованы данные международного проекта gnomAD Exomes (ExAC) для экзонных вариантов и базы gnomAD Genomes для интронных вариантов. Для компьютерной оценки патогенности найденных миссенс-вариантов применяли программы предсказания патогенности замен аминокислот (SIFT, PolyPhen-2, PROVEAN, UMD Predictor). Для компьютерного предсказания эффекта изменений в сайтах сплайсинга или прилежащих к сайту сплайсинга участках использованы программы MutationTaster, Human Splicing Finder и NNSplice.

Результаты обработаны методами вариационной статистики и корреляционного анализа с использованием программного обеспечения XLSTAT2019. Соответствие распределения количественных показателей нормальному закону оценивали с помощью критерия Шапиро–Уилка. В случае распределения показателя, отличного от нормального, он описывался медианой (Ме) и верхним и нижним квартилями [Q1; Q3]. Значимость различия в независимых выборках оценивали посредством критерия Манна–Уитни. Для оценки связи качественных и порядковых признаков строили таблицы сопряженности и на их основе рассчитывали критерий χ2 Пирсона.

Для оценки факторов риска рассчитывали отношение шансов (odds ratio, OR). OR – критерий отношения шансов, отражающий относительный риск развития заболевания при определенном генотипе по сравнению с группой контроля. Полученные данные интерпретировали: если OR=1, то шанс для основной группы равен шансу для контрольной группы; если OR>1, то шанс для основной группы больше шанса для контрольной группы; если OR<1, то шанс для основной группы меньше шанса для контрольной группы. Предполагаемый фактор риска является значимым (т.е. с большой вероятностью вызовет наступление события, например болезнь), если OR больше единицы.

Исследование функционального значения генов АТФ-связывающих белков кислородного метаболизма в биологических путях организма выполнено с помощью онлайн-программы [12] с использованием базы данных STRING [13] известных и прогнозируемых взаимодействий, включающих прямые и функциональные ассоциации. Программа осуществляет математическое прогнозирование на основании баз данных Genomic Context Predictions, High-throughput Lab Experiments, (Conserved) Co-Expression, Automated Textmining. База данных STRING в настоящее время охватывает 24 584 628 белков от 5 090 организмов [12; 13]. Статистически значимыми различия считали при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Все пациенты основной группы страдали тяжелой формой акне, которая клинически характеризовалась множественными открытыми и закрытыми комедонами, воспалительными глубокими папулами, пустулами, узлами, сливающимися в конгломераты, атрофическими рубцами, поствоспалительными застойно-синюшными пятнами с преимущественной локализацией на коже лица, спины и груди. Кожа в очагах поражения имела сальный вид, субъективные ощущения характеризовались от незначительной до умеренной болезненности, усиливающейся при движении и пальпации.

В исследуемой группе нами была проведена стратификация изученных однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphism, SNP) в экзонах (несинонимичные замены), в интронах, в 5’UTR и upstream-регионе по их регуляторной значимости на кодируемые генами АТФ-связывающих белков кислородного метаболизма.

Характеристика полиморфных локусов генов ABCA1, ABCB7, ABCG5, ABCG8 в экзонах (несинонимичные замены) у больных акне представлена в таблице 1. В гене ABCC8 SNPs в экзонах (несинонимичные замены) нами выявлены не были.

Таблица 1

Характеристика полиморфных локусов генов ABCA1, ABCB7, ABCG5, ABCG8 в экзонах у больных акне

Как представлено в таблице 1, по результатам расчета OR выявлено, что 2 SNPs из 5 SNPS гена ABCA1 в экзонах: rs2230808, OR=1,72; -(.), OR=1,22; 1 SNPS гена ABCB7 в экзоне (rs147584361, OR=2,06); 1 SNPS гена ABCG8 (rs6544718, OR=1,34), вероятно, ассоциированы с тяжелым течение акне; тогда как 2 SNPs гена ABCA1, 1 SNPS гена ABCG5 и 1 SNPS гена ABCG8 в экзонах, вероятно, имеют протективный эффект в отношении развития акне (OR<1). При этом достоверное протективное действие в развитии тяжелой формы акне определяет SNPs гена АВСА1 (rs2230806, OR=0,18, ДИ 0,083-0,409; p=0,00003). Все выявленные SNPS генов ABCA1 в экзонах впервые описаны нами при акне, включая 1 SNPs гена ABCA1, ранее не описанный ни при одном заболевании.

Характеристика полиморфных локусов генов ABCA1, ABCB7, ABCC8, ABCG5, ABCG8 в интронах у больных акне представлена в таблице 2.

Таблица 2

Характеристика полиморфных локусов генов ABCA1, ABCB7, ABCC8, ABCG5, ABCG8 в интронах у больных акне

Данные таблицы 2, как оказалось, свидетельствуют о том, что 14 SNPs генов ABCA1, ABCB7, ABCC8, ABCG5, ABCG8 в интронах идентифицированы нами впервые и не были описаны ранее ни при одном заболевании. При расчете OR было установлено, что 4 из 15 SNPs гена ABCA1 (-(.), OR=1,22; -(.), OR=1,53; -(.), OR=1,22; -(.), OR=2,06), 3 из 4 SNPs гена ABCB7 ( -(.), OR=2,06; rs4148837, OR=1,22; rs1039123, OR= 2,48), все 5 SNPs гена ABCC8 8 (rs77960379, OR=1,29; -(.), OR=1,48; rs74684488, OR=1,50;-(.), OR=1,63; rs80205120, OR=2,11), 4 из 7 SNPs ABCG8 (rs56260466, OR=4,66; -(.), OR=2,06; -(.), OR=1,22; -(.), OR=1,96), вероятно, ассоциированы с тяжелым течением акне (OR>1).

При этом 1 SNPs гена ABCA1 в интронах (rs2777801, OR=2,53, p=0,043) достоверно ассоциирован с тяжелым акне, тогда как при 1 SNPs гена ABCB7 в интронах (rs1039123) частота альтеративного аллеля достоверно отличается в группе больных тяжелым акне по отношению к группе контроля (p=0,048), однако риск развития акне лишь вероятен, но не достоверен (OR=2,48, p=0,651).

При этом 2 SNPs гена ABCA1 в интронах (-(.), OR=0,38, p=0,041; rs2243313, OR=0,18, p=0,0003) статистически значимо оказывают протективное действие в развитии тяжелого акне, а один из этих SNPs описан нами впервые и ранее не был описан ни при одном заболевании. Также при 1 SNPs гена ABCG8 в интронах (rs75365565) частота альтеративного аллеля достоверно отличается в группе больных тяжелым акне по отношению к группе контроля (p=0,024), однако риск развития акне лишь вероятен, но не достоверен (OR=0,08, p=0,099).

Характеристика полиморфных локусов генов ABCA1, ABCB7, ABCG5, ABCG8 в 5’UTR и upstream-регионе у больных акне представлена в таблице 3. В гене ABCC8 в 5’UTR и upstream-регионе SNPs нами выявлено не было.

Таблица 3

Характеристика полиморфных локусов генов ABCA1, ABCB7, ABCG5, ABCG8 в 5’UTR и upstream-регионе у больных акне

Как видно из данных, представленных в таблице 3, 1 SNPs в upstream-регионе гена ABCA1 (rs2740483, OR=1,8), 1 SNPs в 5’UTR гена ABCB7 (rs376533117, OR=1,22) и 1 SNPs в 5’UTR гена ABCG5 (rs55853083, OR=1,06) ассоциированы с тяжелой формой акне. Остальные (OR<1), вероятно, имеют протективное значение в развитии акне.

Полученные результаты проведенного нами исследования позволили дать характеристику дефектов генов АТФ-связывающих белков кислородного метаболизма ABCA1, ABCB7, ABCC8, ABCG5, ABCG8 у пациентов с тяжелым течением акне. Все SNPs генов АТФ-связывающих белков кислородного метаболизма впервые выявлены нами у больных тяжелой формой акне; при этом статистически значимое протективное действие в развитии тяжелой формы акне определяет SNPs гена АВСА1 в экзонах (rs2230806, OR=0,18, ДИ 0,083-0,409; p= 0,00003). Кроме того, один SNPs гена ABCA1 в интронах (rs2777801, OR=2,53, p=0,043) достоверно ассоциирован с тяжелым акне. В то же время при 1 SNPs гена ABCB7 в интронах (rs1039123) частота альтеративного аллеля статистически значимо отличается в группе больных тяжелым акне по отношению к группе контроля (p=0,048), однако риск развития акне лишь вероятен, но не достоверен (OR=2,48, p=0,651). Два SNPs гена ABCA1 в интронах (-(.), OR=0,38, p=0,041; rs2243313, OR=0,18, p=0,0003) достоверно оказывают протективное действие в развитии тяжелого акне, а один их этих SNPs описан нами впервые и ранее не был описан ни при одном заболевании. Также при 1 SNPs гена ABCG8 в интронах (rs75365565) частота альтеративного аллеля достоверно отличается в группе больных тяжелым акне по отношению к группе контроля (p=0,024), однако риск развития акне лишь вероятен, но не достоверен (OR=0,08, p=0,099).

Описано, что одним из возможных механизмов транспорта липидов является взаимодействие аполипопротеинов с белком ABCA1 или сходным белком, что вызывает транслокацию внутриклеточного холестерина и фосфолипидов из комплекса Гольджи к плазматической мембране. Другим механизмом может быть перемещение ABCA1-содержащих везикул во внутриклеточные липидные депозиты с последующим перемещением липидов в просвет пузырьков, которые транспортируют липиды обратно в плазматическую мембрану.

Сообщается, что регулирование уровней мРНК ABCA2, ABCA3 и ABCA7 обеспечивается постоянным притоком холестерина, опосредованным ЛПНП. Белок ABCA3 может сыграть важную роль в образовании легочного сурфактанта, который состоит в основном из фосфолипидов и специфических сурфактантных белков, тогда как ABCA7 может участвовать в транспорте гема из митохондрий в цитозоль, а также играть центральную роль в созревании цитозольных белков, содержащих кластер железа и серы. Также установлено, что активация ABCA12 является важным фактором для восстановления барьерной функции кожи [14; 15].

Показано, что синтез и состав себума регулируется внутренними (например, PPAR, LXR, RAR, RXR, эндоканнабиноиды) и внешними (например, андрогены, IGF1, инсулин, лептин) факторами. Липиды себума обеспечивают формирование липидного барьера кожи и проникают через эпидермис в дерму, также предполагают прямую диффузию из сальной железы. Кроме того, показано, что липиды кожного сала являются модуляторами работы как кератиноцитов, так и макрофагов, изменяя уровни экспрессии их генов и белков, поддерживая физиологическую иммунную систему кожи.

PPAR является ядерным рецептором II типа и образует гетеродимеры с другим ядерным рецептором II типа – рецептором ретиноида X (retinoid X receptor, RXR). Гены-мишени PPAR участвуют в транспорте жирных кислот, окислении жирных кислот, клиренсе триглицеридов, производстве липопротеинов и гомеостазе холестерина.

Мембранное распределение внутриклеточных липидов важно для клеточной функции и передачи сигналов. Транспортеры ABC, такие как ABCA1, ABCB4, ABCB11, ABCD1, ABCG1 и ABCG5 / 8, играют решающую роль в поддержании этой организации.

Полученные данные по анализу ген-генных взаимодействий представлены на рисунке.

Ген-генные взаимодействия генов АТФ-связывающих белков кислородного метаболизма.

Цвет линий отражает характер взаимодействий: бирюзовый - из известных баз данных, фиолетовый - экспериментальные данные, зеленый - сродство генов, красный - слияние генов, синий - совпадение генов, желтый - текстовый майнинг, черный - коэкспрессия, голубой - гомология белков (https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene)

Заключение

Полученные варианты нуклеотидной последовательности генов АТФ-связывающих белков кислородного метаболизма ABCA1, ABCB7, ABCC8, ABCG5, ABCG8, по-видимому, ассоциированы с тяжелой формой акне. В результате это может являться причиной нарушения транспортировки липидов в и из клетки, приводя к дисбалансу работы митохондрий и, как следствие, формированию анаэробных условий для размножения C.acnes. Кроме того, нарушение кислородного метаболизма ведет к дисбалансу антиоксидантной системы и активации провоспалительных факторов, включая цитокины, хемокины и факторы роста.

Таким образом, проведенные исследования позволили впервые выявить полиморфные локусы генов АТФ-связывающих белков кислородного метаболизма ABCA1, ABCB7, ABCC8, ABCG5, ABCG8, дисбаланс между которыми, вероятно, является патофизиологическим механизмом развития акне.