Рак печени является четвертым по летальности онкологическим заболеванием в мире, а гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) составляет 75–85% случаев рака печени [1]. В 2018 году смертность от ГЦК составила 782 000 случаев в мире, несмотря на появление многих современных методов диагностики и лечения, что составляет около 3,5% всех смертей в мире [2, 3]. В России показатель смертности составляет около 9 800 случаев в год [4]. Помимо высокой смертности, прогноз и лечение ГЦК неоптимальны, у большинства пациентов злокачественное новообразование прогрессирует в течение года после постановки диагноза [1].

В значительной мере высокая летальность обусловлена не только поздней диагностикой и распространенностью процесса, но и развивающейся, как правило, гепатоцеллюлярной недостаточностью. В России и за рубежом опубликовано значительное количество фундаментальных исследований, посвященных определенным аспектам функциональных состояний печени при различных заболеваниях [5].

Однако научные достижения последних 10–20 лет могут позволить по-новому взглянуть на функции печени при онкологической патологии. В практике врачебной деятельности важнейшее значение приобретают многофакторные методы оценки функции печени на основании клинических, биохимических, морфологических и аппаратно-инструментальных данных. Большое, иногда определяющее, значение эта информация приобретает в онкологии, поскольку ряд злокачественных новообразований печени: гепатоцеллюлярный рак, холангиокарциномы, опухоли желчевыводящих протоков, а также коморбидные заболевания – изменяют как морфологическую структуру, так и ее функции. Кроме того, печень нередко подвергается побочным токсическим влияниям целого ряда химиотерапевтических, системных и таргетных препаратов, широко применяемых в онкологии [6].

Развитие гепатотоксичности имеет место у 10–50% онкологических больных. В этих условиях особое значение приобретают методы клинической оценки функции печени, основанные на биохимических показателях (аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АлТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), гамма-глутамилтрансфераза, общий билирубин, альбумин) [7].

Однако все большую ценность приобретают не их изолированные изменения, а интегральные показатели – индексы. В литературе известны более 20 индексов: индекс соотношения аспартатаминотрансферазы и тромбоцитов (APRI) [8]; система подсчета FIB-4 – комбинация возраста пациента, количества тромбоцитов, АСТ и АлТ [9]; индекс ALBI, рассчитываемый на основании уровня альбумина и общего билирубина плазмы крови [10]; показатель R – отношение активности АлТ (кратность к верхнему пределу нормы (ВПН)) к ЩФ (кратность к ВПН), в том числе его повторная оценка в процессе наблюдения за больным, и др. [11].

Вместе с тем, очевидно, что функциональное состояние печени регулируется на генетическом и транскриптомном уровнях [1]. При этом регуляция функций печени на молекулярном уровне недостаточно изучена, имеются лишь отдельные работы, посвященные этой проблеме [12].

Известно, что пациенты с ГЦК и неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП, жировым гепатозом) имеют различные генетические профили, и эти различия могут быть применены для раннего скрининга и прогнозирования течения заболевания, оценки функционального состояния печени. Огромный потенциал в этом направлении имеет определение таких показателей, как копийность генов (CNV) и уровень транскриптов микроРНК в плазме крови больных ГЦК и НАЖБП, для дифференциальной диагностики этих двух патологий. Также важно провести ассоциативный и корреляционный анализ уровня стандартных биохимических и молекулярных маркеров.

Copy number variation (CNV) представляет собой особый тип вариабельности генетической информации, отражающий дозу гена (число его копий) и опосредованно влияющий на его транскрипционную активность [13, 14]. Уровень CNV можно определять во внеклеточной ДНК (внДНК), циркулирующей в плазме крови [15]. Также показателем, доступным для определения в плазме крови, является уровень транскриптов микроРНК. МикроРНК – это короткие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов, катализируя разрушение мРНК либо ингибируя трансляцию мРНК в белок. МикроРНК вносят значительный вклад в инициацию и развитие различных молекулярных событий, включая онкогенез, прогрессирование и метастазирование опухолей, что делает микроРНК потенциальными биомаркерами [16].

Поэтому целью исследования стал скрининг генетических (CNV) и транскриптомных (микроРНК) маркеров – регуляторов функционального состояния печени у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой и жировым гепатозом.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России за период с 2020 по 2023 гг. Проанализированы данные комплексного клинического и молекулярного обследования 50 больных гепатоцеллюлярной карциномой (по Барселонской классификации «А», «B», «C», «D») и 30 больных неалкогольной жировой болезнью печени, а также 20 доноров без патологии (группа условно здоровых доноров).

Для получения внДНК использовали кровь, взятую путем венопункции у больных ГЦК, больных неалкогольной жировой болезнью печени и у доноров без патологии (группа условно здоровых доноров). Плазму крови отделяли центрифугированием (30 минут, 2000 об/мин, t=10°С). Из плазмы выделяли внДНК фенол-хлороформным методом в модификации Д.С. Кутилина и соавторов [17]. Оценку показателя относительной копийности генов проводили методом количественной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR). Разработку последовательности синтетических олигонуклеотидов (праймеров) осуществляли с помощью Primer-BLAST и базы данных GenBank (NCBI). В качестве референсного гена для нормализации полученных показателей RT-qPCR был выбран GAPDH.

Реакция амплификации проводилась на термоциклере CFX96 (Bio-Rad, США) в 20 мкл смеси, содержащей матрицу внДНК (не менее 0,5 нг), 0,2 мМ раствор dNTP, 0,4 мкМ прямого и обратного праймеров, 2,5 мМ раствор MgCl2, 1X ПЦР-буфер с интеркалирующим красителем EvaGreen и 0,1 е.а./мкл SynTaq ДНК-полимеразы [17]. Амплификация осуществлялась по следующей программе: 95°C 3 минуты, 40 циклов: 95°C 10 секунд, 55°C 30 секунд (чтение оптического сигнала по каналу FAM) и 72°C 20 секунд.

Относительную копийность (rC) рассчитывали по формуле, описанной Д.С. Кутилиным [18]:

rC = rCо/rCн = E-ΔCt(образцов от больных)/E-ΔCt(образцов от условно здоровых),

где Е ‒ эффективность ПЦР-амплификации, рассчитанная по формуле E = 10-1/k (k ‒ коэффициент уравнения прямой C(T) = k•log P0 + b, полученной в ходе линейной аппроксимации данных экспериментальных постановок ПЦР) (усредненное значение Е=1,914), а ΔCt – разница между средним геометрическим Ct(гена-мишени) и средним геометрическим Ct(референсного гена) [18].

С помощью биоинформационного алгоритма TarPmiR определяли микроРНК, таргетирующие локусы GGTLC1, CYC1, LRRC24, AK4, ALB, GOT1, GPT1, GGT1 и ALPL.

Выделение микроРНК из образцов плазмы крови проводили с использованием набора miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, Германия) на автоматической станции выделения Qiacube Connect (Qiagen, Германия) с учетом рекомендаций производителя.

Для выявления зрелых микроРНК и малой РНК U6 использовали метод, описанный I. Balcells и соавторами [19]. Выделенную суммарную РНК использовали в реакции обратной транскрипции, которую проводили одновременно с полиаденилированием РНК, с использованием специфичных RT-праймеров. Далее проводили детекцию полученной кДНК с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров осуществляли также с использованием алгоритма I. Balcells и соавт. [19]. Для каждой микроРНК отдельно проводили реакцию обратной транскрипции в одном повторе.

Изменение относительной экспрессии микроРНК оценивали методом ПЦР-РВ. Амплификацию проводили в 20 мкл PCR-смеси, содержащей 1x PCR-буфер, 0,25 mМ dNTPs, 2 мM MgCl2, 1 ед.акт. Taq-DNA-полимеразы, по 500 нM прямого и обратного праймеров. Полученные смеси инкубировали в амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad Laboratories, США).

Статистическую обработку результатов выполняли в программе Statistica 10.0 (StatSoft, США). Нормальность распределения показателей оценивали с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Оценку различий проводили с использованием критерия Манна–Уитни для порогового уровня статистической значимости р<0,05, для учета множественного сравнения использовали поправку Бонферрони. Для оценки взаимосвязи исследуемых показателей использовали коэффициент корреляции Пирсона (r).

Результаты исследования и их обсуждение

На рисунке 1 представлена сводная информация по клинически применяемым в настоящее время маркерам у группы пациентов и здоровых доноров, отобранных в наше исследование.

Как видно из представленных на рисунке 1 данных, у пациентов с ГЦК относительно здоровых доноров статистически значимо (p<0,005) повышена активность АЛТ, АСТ, ГГТ и щелочной фосфатазы, а также снижена концентрация альбумина.

Был проведен анализ показателя копийности генов АЛТ, АСТ, ГГТ, щелочной фосфатазы, альбумина и ассоциированных с ними генов в образцах внДНК у пациентов с ГЦК, больных неалкогольной жировой болезнью печени и у доноров без патологии. У больных ГЦК было обнаружено увеличение копийности гена GGT1 (Gamma-Glutamyltransferase 1) в 2,5 раза (p<0,005), GGTLC1 (Gamma-Glutamyltransferase Light Chain 1) в 3,0 раза (p<0,05), GOT1 в 1,5 раза (p<0,05) и снижение показателя копийности гена CYC1 (Cytochrome C1) в 4,4 раза (p<0,005) относительно этого показателя в плазме крови здоровых доноров. Копийность гена LRRC24 (Leucine Rich Repeat Containing 24) была повышена в 2,0 раза (p<0,005), гена AK4 (Adenylate Kinase 4) в 3,4 раза (p<0,05), GGT1 в 1,5 раза (p<0,005), GGTLC1 в 2,2 раза (p<0,05), ALPL в 2,6 раза (p<0,05) и снижена копийность CYC1 в 2,0 раза (p<0,05) у больных жировой болезнью печени относительно здоровых доноров

Рис. 1. Характеристика групп по биохимическим маркерам

* – статистически значимые отличия относительно условно здоровых доноров.

** – статистически значимые отличия между больными ГЦК и пациентами с неалкогольной жировой болезнью печени

Группы больных ГЦК и жировой болезнью печени отличались по копийности во внДНК 5 генов: копийность GOT1 (AST1) была выше у больных ГЦК в 1,9 раза (p<0,005), копийность AK4 была ниже у больных ГЦК в 2,1 раза (p<0,0005), копийность GGT1 была выше у больных ГЦК в 1,6 раза (p<0,05), копийность GGTLC1 была выше у больных ГЦК в 1,4 раза (p<0,05), копийность CYC1 была ниже у больных ГЦК в 2,2 раза (p<0,005) и копийность гена ALPL была ниже у больных ГЦК в 2,1 раза (p<0,005) (рис. 2).

Ген ALB кодирует самый распространенный белок в крови человека – альбумин. Этот белок участвует в регуляции коллоидно-осмотического давления плазмы крови и действует как белок-носитель для широкого спектра эндогенных молекул, включая гормоны, жирные кислоты и билирубин, а также экзогенные лекарственные средства. Кроме того, этот белок проявляет эстеразоподобную активность с широкой субстратной специфичностью.

Кодируемый препропротеин подвергается протеолитической обработке с образованием зрелого белка. Пептид, полученный из этого белка, EPI-X4, является эндогенным ингибитором хемокинового рецептора CXCR4. Наибольший уровень экспрессии данного гена наблюдается в печени.

Рис. 2. Показатель копийности генов во внДНК пациентов с ГЦК и жировым гепатозом

Кодируемый препропротеин подвергается протеолитической обработке с образованием зрелого белка. Пептид, полученный из этого белка, EPI-X4, является эндогенным ингибитором хемокинового рецептора CXCR4. Наибольший уровень экспрессии данного гена наблюдается в печени. Ген ALB задействован в целом ряде клеточных сигнальных путей (Reactome pathways): метаболизм желчных кислот и желчных солей, регуляция уровня билирубина, транспорт липидов, метаболизм липопротеинов и трансмембранный транспорт малых молекул.

Ген GOT1 кодирует глутамин-оксалоуксусную трансаминазу 1 (аспартатаминотрансфераза, цитоплазматическая, АСТ), которая играет важную роль в метаболизме аминокислот, циклах мочевины и трикарбоновых кислот, участвует в синтезе глюкозы в печени.

Ген GGT1 кодирует фермент гамма-глутамилтрансферазу 1, который катализирует перенос глутамильной части глутатиона на множество аминокислот и акцепторов дипептидов. Он экспрессируется в тканях, участвующих в абсорбции и секреции, и может способствовать этиологии диабета и других нарушений обмена веществ.

Ген ALPL кодирует фермент щелочную фосфатазу, которая метаболизирует различные фосфатные соединения и играет ключевую роль в минерализации скелета и адаптивном термогенезе [20].

Ген GPT1 кодирует эндогенный фермент аланинаминотрансферазу (АЛТ, АлАт) из группы трансфераз, широко используемый в медицинской практике для лабораторной диагностики повреждений печени. Аланинаминотрансфераза синтезируется внутриклеточно, и в норме лишь небольшая часть этого фермента попадает в кровь. При повреждении печени (при гепатитах, циррозе печени) в результате цитолиза (разрушения клеток) этот фермент попадает в кровь, что выявляется лабораторными методами. Уровень этой трансаминазы может повышаться также при инфаркте миокарда и других состояниях [21].

Ген CYC1 кодирует белок Cytochrome C1 – компонент убихинол-цитохром с оксидоредуктазы, многосубъединичного трансмембранного комплекса, который является частью митохондриальной цепи переноса электронов, которая управляет окислительным фосфорилированием.

Ген AK4 кодирует фермент аденилат киназу (Adenylate Kinase 4), который участвует в поддержании гомеостаза клеточных нуклеотидов путем катализа взаимного превращения нуклеозидфосфатов, а также играет защитную роль в клеточном ответе на окислительный стресс.

Ген GGTLC1 кодирует легкую цепь гамма-глутамилтрансферазы 1 – представителя семейства гамма-глутамилтранспептидаз (ГГТ), которые играют важную роль в метаболизме глутатиона.

Межгенная сеть взаимодействий для локусов ALB, GOT1, GPT1, GGT1 и ALPL представлена на рисунке 3.

Рис. 3. Межгенная сеть взаимодействий для локусов ALB, GOT1, GPT1, GGT1 и ALPL. (Изображение получено при анализе открытых баз данных на языке R)

Гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) – ферменты, участвующие в обмене аминокислот. Катализируют перенос гамма-глутамилового остатка с гамма-глутамилового пептида на аминокислоту, другой пептид или, при гидролизе, на воду. Накапливается в основном в почках, печени и поджелудочной железе. В клетках локализуется в мембране, лизосомах и цитоплазме [22]. ГГТ преимущественно используется в качестве диагностического маркера заболеваний печени. Повышенная активность ГГТ в сыворотке может быть обнаружена при заболеваниях печени, желчевыводящих путей, поджелудочной железы и почек [23]. Гены GGT и GGTLC1 экспрессируются на высоких уровнях во многих различных опухолях. Известно, что они ускоряют рост опухоли и повышают устойчивость к цисплатину [24].

Ген LRRC24 кодирует трансмембранный белок, функция которого в настоящее время неизвестна. Он является членом суперсемейства белков с богатыми лейцином повторами (LRR). Было обнаружено, что LRRC24 взаимодействует с IGFBP7, известным регулятором инсулиноподобных факторов роста (IGF), который участвует в стимуляции клеточной адгезии. Также LRRC24 взаимодействует с GPT1 (рис. 3). На сегодняшний день ни одно исследование не связывало конкретно LRRC24 или ген LRRC24 с каким-либо клинически значимым случаем [25].

Для сопоставления клинических и молекулярно-генетических маркеров рассмотрим таблицу 1.

Таблица 1

Сопоставление биохимических показателей и молекулярно-генетические изменений у больных ГЦК и жировым гепатозом

«↑» – повышенные значения относительно нормы (контрольная группа)

«–» – нет изменений относительно нормы (контрольная группа)

АЛТCNV – показатель копийности гена АЛТ (GPT1), АСТCNV – показатель копийности гена АСТ (GOT1), ГГТCNV – показатель копийности гена ГГТ (GGT1), ЩФCNV – показатель копийности гена щелочной фосфатазы (ALPL)

Из представленных в таблице 1 и на рисунках 1 и 2 данных видно, что изменение активности фермента АЛТ не связано с изменением копийности его гена (r=0,086) у пациентов с ГЦК и НАЖБП. Изменение активности фермента АСТ у больных ГЦК ассоциировано с повышением копийности этого гена (r=0,757), при этом у пациентов с НАЖБП такой ассоциации не наблюдается (r=0,114). Изменение активности фермента ГГТ у больных ГЦК ассоциировано с повышением копийности этого гена (r=0,691), при этом у пациентов с НАЖБП такой ассоциации не наблюдается (r=–0,104). Изменение активности щелочной фосфатазы у больных ГЦК не ассоциировано с изменением копийности этого гена (r=–0,090), при этом у пациентов с НАЖБП наблюдается сильная положительная корреляция активности фермента и копийности его гена (r=0,904). В ходе исследования также не обнаружено положительной корреляции между концентрацией альбумина и копийностью его гена во внДНК пациентов. Хотя для пациентов с НАЖБП между концентрацией альбумина и копийностью гена ALB в тканях печени обнаружена положительная корреляция (r=0,574).

Также представляет интерес изучение одного из механизмов регуляции транскрипционной активности генов GGTLC1, CYC1, LRRC24, AK4, ALB, GOT1, GPT1, GGT1 и ALPL – изменение экспрессии микроРНК.

С помощью модифицированного биоинформационного алгоритма TarPmiR было определено 4643 микроРНК, таргетирующих локусы GGTLC1, CYC1, LRRC24, AK4, ALB, GOT1, GPT1, GGT1 и ALPL. Из этих микроРНК только 588 были валидированы в базе данных miRDB, в том числе 413 микроРНК, образующих наиболее прочные комплексы с соответствующими генами-мишенями (минимальная свободная энергией взаимодействия в паре микроРНК-мРНК): 30 микроРНК для гена ALB, 66 микроРНК для AK4, 12 микроРНК для ALPL, 2 микроРНК для CYC1, 35 микроРНК для гена GGT1, 47 микроРНК для гена GGTLC1, 133 микроРНК для гена GOT1, 83 микроРНК для гена GPT и 5 микроРНК для гена LRRC24 (табл. 2).

Таблица 2

Данные по микроРНК-мРНК взаимодействию, полученные с использованием алгоритма TarPmiR

«...» – разрыв таблицы (конец фрагмента)

Из выявленных микроРНК наиболее стабильное взаимодействие с генами имели 49 (табл. 3).

Таблица 3

Перечень микроРНК, наиболее эффективно взаимодействующих с мРНК генов-мишеней

Анализ уровня транскриптов этих 49 микроРНК мы провели на образцах плазмы крови больных ГЦК и НАЖБП. В качестве контроля использовали группу условно здоровых доноров. Результаты представлены на рисунке 4. Обнаружено статистически значимое (p<0,005) увеличение экспрессии hsa-miR-7706 в 1,8 раза и hsa-miR-6775-5p в 2,1 раза у больных НАЖБП и статистически значимое (p<0,005) снижение экспрессии hsa-miR-671-5p в 2,0 раза у больных ГЦК относительно здоровых доноров. Обнаружено увеличение экспрессии hsa-miR-6796-5p в 1,7 раза у больных НАЖБП. У больных ГЦК также выявлено снижение экспрессии hsa-miR-2467-3p, hsa-miR-939-3p и hsa-miR-10401-5p в 2,0, 2,5 и 1,7 раза, hsa-miR-6786-5p и hsa-miR-6805-3p в 2,5 и 5,0 раз относительно здоровых доноров.

Рис. 4. Уровень экспрессии 49 микроРНК в образцах плазмы крови больных ГЦК и НАЖБП

При этом у данных пациентов наблюдается увеличение экспрессии микроРНК hsa-miR-4730, hsa-miR-1976 и hsa-miR-6774-5p в 1,7, 1,9 и 2,5 раза соответственно.

Заключение

Таким образом, проведенное комплексное исследование показателей копийности генов и экспрессии микроРНК в плазме крови и сравнение с данными биохимических обследований пациентов с ГЦК и НАЖБП позволило как установить особенности регуляции функционального состояния печени – активности ферментов АЛТ, АСТ, ГГТ и щелочной фосфатазы и концентрации альбумина, так и выявить генетические и транскриптомные маркеры этих заболеваний.