Введение

Разработка инновационных лекарственных препаратов остаётся одной из наиболее ресурсозатратных областей биомедицины: на поздних стадиях клинических исследований значительная доля смоделированных молекул-кандидатов отсеивается из-за недостаточной эффективности, высокой токсичности, несоответствия международным требованиям безопасности, поскольку они не были своевременно выявлены на ранних этапах скрининга [1]. С этой позиции молекулярное моделирование и вычислительные подходы к оценке свойств соединений постепенно переходят из «вспомогательных» инструментов в обязательный элемент раннего прогнозирования биологической активности и токсичности соединений, позволяя прогнозировать риски еще не синтезированных молекул и рациональнее распределять экспериментальные ресурсы.

Особую роль в инновационном поиске перспективных фармакологически активных молекул играет раннее in silico-профилирование биологической активности и токсичности молекул активных субстанций. С одной стороны, фармакологическая активность определяется не только взаимодействием молекулы с «целевой» мишенью, но и спектром потенциальных биохимических эффектов, способных формировать нежелательные реакции и ограничивать терапевтическое окно исследуемой субстанции. С другой стороны, неблагоприятный ADMET-профиль молекулы является одной из ключевых причин позднего исключения молекулы из исследования, что приводит к переносу оценки этих параметров как можно ближе к началу исследования структуры-активности [1]. В результате возрастает практическая ценность онлайн-инструментов, позволяющих быстро получить прогноз по нескольким параметрам безопасности и выявить точки уязвимости молекулы ещё до постановки трудоёмких и дорогостоящих биологических тестов.

Одновременно с развитием научно-технического прогресса и возникновением новых глобальных вызовов в мировом медицинском сообществе, активно развивается направление хемоинформатики, ориентированное на изучение молекулярного докинга, прогнозирования биологической активности препаратов, а также разработки инновационных молекул и подходов в терапии. Если раньше многие методы молекулярного моделирования требовали специализированного программного обеспечения и навыков работы с вычислительными программами, то сегодня заметная часть прогностических задач решается через онлайн-сервисы. Веб-сервисы имеют низкие требования к форматированию смоделированной молекулы, ускоряют первичный скрининг и облегчают воспроизводимость результатов. Наибольшее распространение в современной хемоинформатике имеют комбинированные схемы отбора молекул, суть которых заключается в применении более «жёстких» критериев безопасности/качества, а число отобранных молекул-кандидатов последовательно уменьшается - от набора виртуальных производных к 1–2 наиболее перспективным соединениям, подлежащим более углублённому исследованию.

В контексте прогнозирования токсичности и комплексной оценки риска использования смоделированных молекул активно применяются специализированные онлайн-платформы, объединяющие несколько токсикологических и биологических параметров. Например, ProTox 3.0 позиционируется как «виртуальная токсикологическая лаборатория» и предоставляет пользователям возможность спрогнозировать параметры токсикологической оценки () [2]. Для решения задач ADMET-профилирования применяются комплексные платформы, например admetSAR 3.0, которая позволяет провести систематическую оценку ADMET-свойств и токсичности молекулы [3].

В настоящее время молекулярное моделирование является актуальным направлением хемоинформатики, способствующим расширению возможностей создания молекул в отсутствие эмпирического подхода. Онлайн-сервисы, работающие на основе актуальных баз данных химических субстанций, позволяют проводить воспроизводимый скрининг «активность - безопасность» на ранних этапах формирования молекулы. С целью увеличения результативности используемых алгоритмов учёные используют каскадный метод проверки биологической активности и токсичности смоделированных субстанций.

Цель исследования

Проведение каскадного кейс-исследования биологической активности и токсичности в онлайн-сервисах Pass online, ProTox, admetSAR для смоделированных молекул «Ламотриджин– 1-5».

Материалы и методы исследования

Для оценки функциональных особенностей онлайн-сервисов был проведен поэтапный каскадный скрининг модифицированных структур с последовательным исключением кандидатов по критериям безопасности и риска нежелательных побочных реакций. Скрининг проводился на основе сравнения референсной молекулы лекарственного препарата «Ламотриджин» (PubChem CID: 3878; ИЮПАК: 6-(2,3-дихлорфенил)-1,2,4-триазин-3,5-диамин) со смоделированными авторами виртуальными производными: «Ламотриджин – 1 – 5», в программе ACD/ChemSketch с последующим экспортом структур в формат SMILES для ввода в онлайн-сервисы.

Выбор препарата «Ламотриджин» опосредован высокими рисками возникновения побочных реакций и выраженными лекарственными взаимодействиями с группой вальпроатов. В связи с этим поиск наиболее безопасной молекулы может повлиять на безопасность терапии и комбинированное назначение препаратов, действующих на центральную нервную систему.

Для каждой из смоделированных производных предполагалось изменение структуры активных функциональных групп с учётом сохранения исходной структуры фенилтриазинов. Пять вариантов «Ламотриджин – 1 – 5» виртуальных производных референсной молекулы «Ламотриджин» были проанализированы в трех онлайн-сервисах (Pass online, виртуальная токсикологическая лаборатория ProTox, admetSAR) для прогнозирования in silico их токсичности и биологической активности.

Проведенное кейс-исследование заключалось в поэтапном прогнозировании биологической активности и токсичности при помощи онлайн-сервисов, а также в последовательном исключении кандидатов по критериям безопасности и риска. Каждый онлайн-сервис имел индивидуальную шкалу оценки активности/токсичности. Так, в программе Pass online релевантными считались значения показателя >0,7, для оценки данных, полученных в виртуальной лаборатории ProTox, использовались установленные в программу визуальные шкалы, акцентирующие полученный результат с помощью цветовых сигналов (зеленый – положительный; красный – отрицательный), а также шкал токсичности (GHS-класс токсичности). Веб-сервис admetSAR автоматически оценивал параметры биодоступности и токсичности виртуальных производных, представляя полную сводку результатов в отчетном документе, оснащенном как визуальными иконками доступности (зеленый – безопасный; красный - опасный), так и процентным подтверждением полученного прогноза.

Результаты исследования и их обсуждение

Систематический поиск литературы позволил выявить перспективность исследования функциональных особенностей программ для in silico-прогнозирования фармакологических свойств молекул, а также определить необходимость дальнейшего изучения представленного вопроса с позиции валидации методов работы с онлайн-сервисами [2-4]. Проанализировав исследования в данной тематике, авторы выявили, что, несмотря на разнообразность оцениваемых параметров, онлайн-сервисы admetSAR, Pass online, ProTox способствуют значительной экономии времени и финансовых затрат на этапах разработки и доклинической проверки молекулы лекарственного препарата, а также являются одними из часто применяемых [5-7]. Современной науке известны сотни случаев эффективного прогнозирования биологической и метаболической активности новых производных химических молекул. К таким исследованиям относятся: публикации прогноза эффективности и токсичности новых производных пирана, изучение метаболизма и токсичности микотоксина, ADMET-оценка инновационных стероидных соединений [5; 6]. Авторы международных публикаций акцентируют внимание на том, что использование онлайн-сервисов является одним из наиболее распространённых направлений молекулярного моделирования молекул [8], не требующего для использования дополнительных знаний по программированию и написанию цифрового кода. Своевременная актуализация рабочего интерфейса онлайн-программ и устранение систематических ошибок позволяет использовать данные сервисы в образовательных, научных и биотехнологических целях [6-9]. Онлайн-скрининг используется многократно в биотехнологической сфере, поскольку позволяет проанализировать более 50 альтернативных соединений за несколько минут и составить структурный план для дальнейшей работы с молекулами [10]. Изучению разнообразных онлайн-сервисов посвящено множество исследований, оценивающих их функционал и дальнейшую воспроизводимость in vitro [7-9]. Наибольшую клиническую значимость данные онлайн-сервисы получили при разработке противоопухолевых препаратов, необходимость инновационного синтеза которых увеличивается с каждым годом. Онлайн-сервисы позволили выявить более 3 тыс. активных соединений, имеющих положительные прогностические противоопухолевые свойства, с учетом высокой достоверности результатов [11; 12]. К таким препаратам относятся производные витанолидов [10] и смоделированный лабораторный противоопухолевый образец «СС-43» [3]. Несмотря на значительные успехи в области таргетной противоопухолевой терапии, учёные акцентируют внимание на том, что наиболее перспективным является комплексный подход к оценке биологической активности и токсичности молекул в онлайн-сервисах [13-15]. Необходимость комплексности обусловлена тем, что каждый онлайн-сервис, как правило, специализирован на прогнозировании ограниченного набора параметров, поэтому для получения целостного профиля смоделированного соединения требуется последовательное применение нескольких онлайн-платформ.

Основывая проведение практической части кейс-исследования на данных о необходимости комплексного анализа прогнозирования in silico, авторы смоделировали 5 виртуальных молекул «Ламотриджин 1-5» на основе зарегистрированного на фармацевтическом рынке референсного препарата «Ламотриджин». Данные об изменении химической структуры с визуальным уточнением моделированных функциональных групп референсного препарата изложены в таблице 1.

Таблица 1

Структурные формулы и SMILES-представления модифицированных производных референсной молекулы «Ламотриджин»

Источник: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Каждая молекула анализировалась в онлайн-сервисе Pass online, где возможна оценка биологической активности и предварительной токсичности исследуемой субстанции. В рамках работы было выявлено, что наиболее активными были виртуальные модели «Ламотриджин – 1», «Ламотриджин – 2», «Ламотриджин – 3», «Ламотриджин – 4», которые хоть и имели предполагаемую высокую токсичность, но нуждались в дополнительной оценке токсических свойств. Необходимо отметить, что в рамках исследования авторами анализировались, как правило, наиболее выраженные фармакологические эффекты, исключая эффекты опосредованного влияния на биохимические реакции в организме человека. Результаты оценки прогнозирования in silico в онлайн-сервисе Pass online отражены в таблице2.

Таблица 2

Оценка токсичности и биологической активности виртуальных молекул «Ламотриджин 1-5» в онлайн-сервисе Pass online

Примечание: в таблице отражены эффекты и виды токсичности, имеющие >0,7. Источник: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Наличие ряда важнейших клинических эффектов в виртуальных производных «Ламотриджин – 1», «Ламотриджин – 2», «Ламотриджин – 3», «Ламотриджин – 4» референсной молекулы фармакологического препарата «Ламотриджин», не обладающего в исходной версии представленными эффектами, требовало дополнительной оценки уровня токсичности (GHS-класс токсичности). Класс токсичности оценивался по 6-балльной шкале, где уровень 1 – наиболее токсичная молекула, а уровень 6 – наиболее безопасная молекула. Проверка была осуществлена в онлайн-версии виртуальной лаборатории ProTox. Результаты проведенной оценки представлены в таблице 3. Интерпретация полученных результатов комбинировалась с визуальным аналитическим классификатором.

Таблица 3

Результаты проверки параметров активной и неактивной токсичности в виртуальной лаборатории ProTox

Примечание: BBB (Blood–Brain Barrier) – токсичность, вызванная прохождением через гематоэнцефалический барьер. Источник: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Отчёт о модели нетоксичных параметров показывал вероятность отсутствия представленных эффектов в смоделированной молекуле и был отмечен зеленым цветом, как безопасный. Отчёт о токсичности с вероятностью возникновения анализировался в процентах, а также визуально классифицировался на наиболее активные эффекты, отмеченные красным цветом, и менее активные эффекты, отмеченные розовым цветом.

Проведенная проверка на определение биологической активности и токсичности в виртуальной лаборатории ProTox позволила выявить одну смоделированную молекулу «Ламотриджин – 1» с высокой точностью предварительного прогнозирования (69,26%) и низким GHS-классом токсичности (4 класс). В результате второго этапа последовательного скрининга был выявлен финальный кандидат, соответствующий всем требованиям совокупных критериев безопасности, токсичности и фармакологического профиля. Данная молекула участвовала в третьем этапе скрининга в онлайн-сервисе admetSAR для определения уровня метаболических параметров системы ADME (всасывание, распределение, метаболизм, всасывание). Дополнительно в рамках исследования в программе admetSAR производилась оценка смоделированной молекулы на токсичность (ADMET – параметры). Функциональные возможности программы admetSAR подразумевали разнообразный список исследуемых параметров биодоступности, но при анализе авторы ориентировались на наиболее распространённые показатели, такие как: Caco-2; %F, ВВВ; PPB; MATE; P – gp; CYP2C19, CYP2D6; Clr; . Результаты, полученные в ходе третьего этапа кейс-исследования молекулы «Ламотриджин – 1», представлены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты оценки ADMET–параметров онлайн-прогнозирования «Ламотриджин – 1» в программе admetSAR

Примечание: красный – вероятность возникновения [0,7–1,0]; оранжевый – вероятность возникновения [0,3–0,7]; зеленый - вероятность возникновения [0–0,3]. Источник: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Полученные результаты исследования позволили оценить молекулу «Ламотриджин – 1» с позиции изучения ключевых параметров биодоступности молекулы. Для представленной молекулы уровень нефротоксичности составил 84,8%, что свидетельствовало о недопустимом уровне риска для дальнейшего синтеза созданной молекулы.

Проведенное исследование в онлайн-сервисах позволило быстро и с высокой долей вероятности оценить смоделированную молекулу с позиции биологических и токсических параметров, а также оценить возможность её дальнейшего синтеза для проведения экспериментальной проверки на лабораторных животных.

Заключение. Каскадное кейс-исследование позволило выявить положительные и негативные стороны использования онлайн-сервисов для прогнозирования in silico безопасности смоделированных молекул. К положительным сторонам относились: эргономичность, доступность и быстрота исследования, не сопровождающаяся финансовыми затратами на предварительное тестирование. Негативные стороны были выражены необходимостью постоянной актуализации информации о молекулах в открытых базах данных и необходимостью использования для дальнейшего анализа специализированных программ и ПО, позволяющих провести комплексную оценку для более чем 100 молекул за один раз. Полученные данные свидетельствуют о необходимости создания актуального алгоритма оценки онлайн-сервисов, с целью выявления сервисов с высокой доказательной базой и эргономичностью использования.