Введение животным лекарственных средств в сочетании с адъювантами усиливает специфический иммунный ответ и пролонгирует действие использованных веществ [1; 2]. При проведении длительного эксперимента с внутрибрюшинным введением крысам галоперидола было обнаружено, что у животных резко нарастает содержание аутоантител к рецепторам (дофаминовым и NMDA-рецепторам) [3; 4]. При этом нарастание уровней аутоантител (ААТ) происходит как в сыворотке крови, так и в ткани переднего мозга крыс [5]. Применение нейролептика с адъювантом также обеспечивало аутоиммунный ответ, практически сопоставимый с длительным (ежедневным) применением галоперидола в аналогичной разовой дозе в течение одного месяца [6].

Цель исследования

Поскольку нейролептики способны воздействовать на дофаминергическую и адренергическую системы головного мозга, представлялось интересным изучить изменение содержания дофамина и норадреналина в ткани переднего мозга крыс (где представлены в том числе стриатум и лобная кора) и сопоставить эти изменения с вариативностью концентрации ААТ к нейрорецепторам в гомогенатах ткани переднего мозга и в сыворотке крови.

Материалы и методы исследования

Эксперименты проведены с соблюдением международных и российских этических норм и стандартов лабораторной практики (Европейская конвенция о защите позвоночных животных, 1986; Принципы надлежащей лабораторной практики ГОСТ Р 53434-2009; Приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 и др.). Этический комитет при ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России одобрил проведение выполненных опытов на животных (Протокол № 114 от 15.12.2022 г.).

Опыты выполнены на белых крысах-самцах линии Вистар в возрасте 3 месяца с массой тела 260-290 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария, при свободном доступе к корму и воде. Были сформированы 4 экспериментальные группы животных (по 5 крыс в каждой), размещавшихся в отдельных клетках. I и II группам крыс вводили внутрибрюшинно галоперидол в дозе 0,5 мг/кг в сочетании с адъювантом - алюминия гидроокись (ААГ) однократно, III и IV группам – галоперидол (0,5 мг/кг) с ААГ двукратно с интервалом 7 суток. Животным контрольной группы, также 5 крыс, внутрибрюшинно вводили физиологический раствор также два раза. Таким образом, в исследовании было использовано 25 крыс. Все инъекции осуществляли с 9 до 10 часов. Суспензию галоперидола с адъювантом - Imject Alum готовили согласно инструкции производителя - Thermo Fisher Scientific (США).

У контрольных животных забирали венозную кровь (из хвостовой вены) через 3 суток после второй инъекции физиологического раствора. Затем животных под общим наркозом декапитировали, и извлекали из черепа головной мозг. Очищали от сосудистой сети и замораживали в морозильной камере при температуре -40 °С. У крыс I группы через 3 суток после применения галоперидола забирали из вены хвоста кровь. У животных II группы кровь брали через 7 суток после однократного инъецировании нейролептика. Головной мозг извлекали и замораживали по аналогичной схеме. В III группе забирали кровь из вены хвоста через 3 суток после второй инъекции галоперидола, а в IV – через 7 суток второго введения галоперидола с ААГ. Головной мозг извлекали и замораживали по аналогичной схеме. Из венозной крови животных получали сыворотку, которая хранилась также в морозильной камере при -40 °C.

Перед исследованием выделяли передний мозг, и его гомогенизировали. Для изучения ААТ (IgG) к гомогенату добавляли охлажденный фосфатно-солевой буферный раствор (рН 7,4) в соотношении «ткань: буфер – 1:3», осаждали центрифугированием при 3000 об./мин. в течение 10 минут. Надосадочная жидкость использовалась для проведения иммуноферментного анализа.

Определение уровней ААТ к NMDA-рецепторам (NR1, NR2A и NR2B субъединицы), и к дофаминовым рецепторам первого и второго типа (DR1 и DR2) в сыворотке крови и супернатанте гомогената головного мозга проводили с помощью ИФА тест-систем (ООО НПО «Иммунотэкс», Россия). Исследование проводили на иммуноферментном анализаторе вертикального сканирования «Лазурит» (США).

Выполняли также определение дофамина и норадреналина в гомогенате ткани переднего мозга животных с помощью флюориметрической методики, детально описанной в литературе [7]. Определение производили на флюориметре «Флюорат®-02-АБЛФ-Т» -полуавтоматический биохимический анализатор медицинского назначения. Результаты оценивались в нг/г ткани мозга.

Статистический анализ полученных результатов измерений проводился с применением прикладных программ Statistica 7 (StatSoft Inc., США). Поскольку распределение показателей отличалось от нормального, применяли критерии непараметрической статистики (критерии Краскела - Уоллиса и Манна - Уитни) [8; 9].

Различия показателей считались статистически значимыми при уровне значимости p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В контрольной группе крыс уровень дофамина в ткани переднего мозга составил Ме=1136 нг/г (Q1/3 – 1128/1154), уровень норадреналина Ме=389 нг/г (Q1/3 – 374/405). У всех крыс, получавших галоперидол, обнаруживались существенно меньшие уровни как дофамина, так и норадреналина в ткани головного мозга (р<0,05) (табл. 1). У животных I группы (однократное введении галоперидола с ААГ) при тестировании через 3 суток после инъекции содержание дофамина было выше, чем у крыс II группы (р=0,012). Содержание норадреналина в ткани мозга у животных II группы было меньше, чем у крыс I группы (р=0,047).

Таблица 1

Сравнительная оценка содержания дофамина и норадреналина (нг/г) в ткани переднего мозга, а также уровней аутоантител в мозговой ткани и в сыворотке крови в группе контроля и у животных I и II групп [Me (Q1/Q3)]

Таблица составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Содержание ААТ в ткани головного мозга у животных, получавших нейролептик, было статистически достоверно выше, чем у контрольной группы крыс (р<0,05). Самые высокие уровни ААТ были обнаружены у I группы крыс (табл. 1). При этом для ААТ к NR2A различия между I и II группами крыс были значимыми (р=0,040).

У животных, получавших галоперидол с ААГ, уровни всех видов изученных ААТ в сыворотке крови были выше по сравнению с контролем. Различий между I и II группами не было выявлено.

У крыс, которым галоперидол с адъювантом вводился два раза, также прослеживалось достоверное снижение уровня мозгового дофамина и норадреналина по сравнению с контрольными животными (p<0,05). Самые низкие уровни дофамина были обнаружены у крыс III группы (определение катехоламинов и ААТ через 3 суток после второго введения препарата) (табл. 2). При этом именно у крыс III группы были обнаружены самые высокие значения содержания ААТ в ткани мозга к NR2A [Me=20,8 ЕД/мл (Q1/3 - 20,6/21,5)], NR2B [Me=16,5 ЕД/мл (Q1/3 - 14,8/16,6)]. У этих же животных были наиболее высокие уровни ААТ в крови к NR2A субъединице NMDA рецептора (табл. 2).

Таблица 2

Сравнительная оценка содержания дофамина и норадреналина (нг/г) в ткани переднего мозга, а также уровней аутоантител в мозговой ткани и в сыворотке крови в группе контроля и у животных III и IV групп [Me (Q1/Q3)]

Таблица составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

У крыс IV группы при тестировании через 7 суток после второй инъекции нейролептика содержание дофамина в ткани мозга значимо превышало его уровень у животных III группы (р=0,012). Содержание норадреналина в ткани мозга между этими группами практически не различалось.

Прослеживалась общая тенденция к уменьшению концентрации ААТ при более поздних определениях. Уровень всех ААТ в мозге был ниже при тестировании через 7 суток (IV группа), чем через 3 дня после повторного введения препарата (III группа) (р<0,05). Содержание ААТ в крови также имело тенденцию к снижению. Однако статистически достоверными были различия по концентрации сывороточных ААТ к субъединице NR2A (р=0,037). Можно предположить, что образование ААТ связано с экспрессией определенных рецепторов. Действительно, ранее было обнаружено, что длительное введение галоперидола вызывает увеличение количества дофаминовых рецепторов (DR1) в ткани переднего мозга крыс [10]. Именно к этим рецепторам и были обнаружены наиболее высокие уровни ААТ.

Факт снижения уровня дофамина в структурах головного мозга под влиянием нейролептиков хорошо известен и подтвержден для атипичных антипсихотиков [11; 12]. Однако важно подчеркнуть, что снижение уровня катехоламинов под влиянием галоперидола совпадало с более высоким содержанием ААТ и в переднем мозге крыс, и в сыворотке крови. При этом самые высокие уровни ААТ были обнаружены у крыс III группы, у которых по сравнению с другими животными выявлялись минимальные значения мозгового дофамина. Можно предположить, что есть взаимосвязь тормозного воздействия нейролептика на дофаминергическую систему с аутоиммунным ответом. Если учесть, что общее количество введенного галоперидола (с адъювантом) было минимальным, логично предположить, что его антидофаминовое действие при одно- или двукратном введении было потенцировано (или реализовано) блокирующим действием ААТ (IgG) на соответствующие рецепторы (DR1, DR2) и NMDA (субъединицы NR1, NR2A, NR2B). Аутоиммунным ответом на введение минимальных доз нейролептика, вероятно, можно объяснить и терапевтическое действие сверхмалых доз антипсихотических средств, обнаруженное в психиатрической клинике [13, с. 30, с. 153]. Видимо, с этим же механизмом можно связывать обнаруженное действие минимальных доз психотропных средств в экспериментах на животных, в частности выявленное влияние сверх малых доз галоперидола [14]. Если учесть, что повторный ответ иммунной системы организма в меньшей степени зависит от дозы, а уровень циркулирующих антител может резко увеличиваться при повторном поступлении небольших количеств антигена [15], возможность такого аутоиммунного влияния нейролептиков на психические функции представляется весьма вероятной.

Заключение

Таким образом, введение крысам галоперидола с адъювантом (гидроокись алюминия) вызывает снижение в ткани переднего мозга содержания дофамина и норадреналина. Эти изменения совпадают с увеличением в ткани мозга и в сыворотке крови аутоантител к дофаминовым рецепторам 1 и 2 типа и к NMDA-рецепторам.