Введение

Плоскоклеточный рак лёгкого (ПКРЛ) остаётся одной из ведущих причин онкологической смертности во всём мире. Несмотря на внедрение современных методов лечения, включая новые схемы лекарственной терапии и совершенствование хирургических подходов, прогноз при местнораспространённых формах остаётся неблагоприятным. Наиболее гетерогенной и прогностически сложной является IIIA стадия, где пятилетняя выживаемость редко превышает 30–35% даже после радикального лечения [1; 2]. В последние годы становится всё более очевидным, что опухолевое микроокружение (ОМO) играет ключевую роль в биологии немелкоклеточного рака лёгкого. Оно включает не только опухолевые клетки, но и широкий спектр иммунных и стромальных элементов, которые определяют течение болезни и эффективность терапии [3]. Среди клеток ОМО особое место занимают опухоль-ассоциированные макрофаги (TAM). Макрофаги способны выполнять различные функции: они могут участвовать в противоопухолевом иммунном ответе, но при определённых условиях - наоборот, способствовать прогрессированию заболевания, усиливая ангиогенез, инвазию и формирование иммунной толерантности [4]. Эти клетки не бывают статичными: под влиянием сигналов из опухолевого микроокружения они меняют своё состояние и занимают разные позиции между условными «провоспалительными» (М1) и «альтернативно активированными» (М2) фенотипами [5]. Для оценки макрофагального окружения в клинических исследованиях наиболее часто используют CD68 как универсальный маркер, отражающий общее количество макрофагов. Дополнительно применяют CD206, который традиционно связывают с М2-подобными клетками, вовлечёнными в иммуносупрессию и ремоделирование тканей. Однако последние исследования подчёркивают, что экспрессия CD206 не является строго специфичной: она может выявляться и при промежуточных фенотипах, что подтверждает сложность и пластичность TAM [6-8]. Таким образом, изучение экспрессии CD68 и CD206 в различных зонах опухоли (строма и паренхима) и их связи с клиническими характеристиками и выживаемостью пациентов с ПКРЛ IIIA стадии имеет важное значение для понимания биологии болезни и разработки прогностических моделей.

Цель исследования – оценить взаимосвязь выживаемости пациентов с плоскоклеточным раком лёгкого IIIA стадии с клиническими характеристиками и иммуногистохимическими показателями опухоль-ассоциированных макрофагов в строме и паренхиме.

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено на базе ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России (г. Ростов-на-Дону). В анализ включены клинические и лабораторные данные 31 пациента с плоскоклеточным раком лёгкого IIIA стадии. Пациенты получили первым этапом хирургическое лечение в период с 2018 по 2020 год. Для анализа прогноза пациенты были разделены на две группы в зависимости от продолжительности общей выживаемости: короткоживущие (ОВ < 42 мес.) (n = 20) и долгоживущие (ОВ ≥ 42 мес.) (n = 11). Критерием разделения послужила медиана (Me) общей выживаемости в исследуемой когорте. Таким образом, из-за малого объема выборки исследование считается ограниченным. Возраст больных, включенных в исследование, составил: в группе короткоживущих – от 48 до 71 лет (Me –64,5); в группе долгоживущих – от 58 до 68 лет (Me- 65,0). Тип хирургического вмешательства распределился следующим образом: лобэктомия - 14 случаев, билобэктомия - 5, пневмонэктомия - 12. После хирургического лечения была проведена послеоперационная адъювантная химиотерапия: в 16 случаях использовали комбинацию карбоплатина с паклитакселом (4 курса паклитаксел 175 мг/м2 в/в кап. в 1-й день + карбоплатин AUC 5-6 в/в кап. в 1-й день 1 раз в 21 день), в 12 - цисплатин с гемцитабином (4 курса цисплатин 75 мг/м2 в/в в 1-й день, гемцитабин 1000 мг/м2 в/в в 1-й и 8-й день 21-дневного цикла), в 3 - цисплатин с этопозидом (4 курса цисплатин 75 мг/м2 в/в в 1-й день, этопозид 100 мг/м2 в/в в 1, 2 и 3-й день 28-дневного цикла). Курение и наличие сопутствующей патологии (сахарный диабет 2 типа, гипертоническая болезнь) фиксировались по медицинской документации. Проводилась оценка по размеру опухоли (T) и вовлеченности регионарных лимфоузлов (N). Для патоморфологического анализа фраг­менты тканей легкого фиксировали в 10% нейтральном растворе забуференного формалина в течение 24 ча­сов. Гистологически материал проводили в автоматическом гистопроцессоре Leica ASP6025 (Германия). После заливки в пара­фин на станции HistoCore Arcadia (Германия) изготав­ливали гистологические срезы толщиной 3–4 мкм с помощью микротома Microm HM 325 с последующим их окрашиванием гематоксилином и эозином. Для иммуногистохимического исследования (ИГХ) были взяты моноклональные мышиные антитела к CD206 (Orb94710, Biorbyt Ltd., Великобритания, в разведении 1:300) и к CD68 (Kp-1, Cell Marque, США, в разведении 1:500). Для визуализации применяли систему детекции HiDef DetectionTMHRP Polymer System (Cell Marque, США). Протокол для ИГХ-исследования использовали, опубликованный ранее в статьях для исследования других показателей (топоизомеразы-2α, E-кадгерина, ki-67, р53) [7-9]. Оценка результатов иммуногистохимической реакции проводилась с применением светового микроскопа «AxioLab.A1» (Германия) при увеличении объектива х200, х400. Экспрессию CD68 и CD206 выявляли путем подсчета количества положительно окрашенных данными маркерами опухолевых клеток, приходящихся на 100 опухолевых клеток в процентном содержании в нескольких полях зрения. Статистическая обработка данных проводилась с использованием программ Statistica 13.0 (StatSoft Inc., США) и Microsoft Excel 2016. Для сравнения количественных признаков между группами применяли критерий Манна – Уитни. Категориальные признаки анализировали χ²-тестом, при нарушении условий применимости (все ожидаемые частоты ≥5) - критерий Фишера. Для оценки взаимосвязей использовали коэффициент корреляции Спирмена. При множественных сравнениях применяли поправки Бонферрони и Бенджамини – Хохберга (FDR). Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Проведенный иммуногистохимический анализ для оценки макрофагального микроокружения опухоли выявил некоторые особенности. Подсчет окрашенных клеток маркерами CD68 и CD206 проводили в стромальном компоненте и в паренхиме опухоли (табл.). В результате было выявлено, что статистически значимые отличия в уровне экспрессии были определены только у маркера CD68 в строме. Медиана значений CD68 в строме у долгоживущих пациентов превышала в 1,4 раза (p=0,002) медиану значений данного маркера у короткоживущих больных (табл.).

Уровень экспрессии CD68 и CD206 в различных зонах опухоли

Примечание: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

Различия в уровне значений экспрессии CD68 в паренхиме были менее выраженными: медиана маркера у долгоживущих превышала показатель короткоживущих в 1,2 раза (6,0 против 5,0; p=0,367), что не достигало статистической значимости даже до поправки на множественные сравнения. В отношении CD206 в строме и паренхиме медианы оказались без особых различий (строма: 10,0 против 10,0; паренхима: 3,0 против 3,5; отношение медиан 1,00 и 0,86 соответственно), что не сопровождалось статистической значимостью (строма: p=0,600; паренхима: p=0,852). Таким образом, повышенная экспрессия CD68 в строме ассоциировалась с более благоприятной выживаемостью, тогда как показатели CD68 в паренхиме и CD206 в обеих зонах статистически значимых межгрупповых различий не демонстрировали.

В результате проведенного анализа заметных различий между клиническими параметрами и уровнем экспрессии исследуемых маркеров чаще всего не наблюдали. Исключением стал маркер CD68 в строме: у пациентов с коморбидной патологией его значения статистически значимо ниже в 2 раза (p=0,006), значимость сохраняется и после учёта множественных проверок (q=0,029). Для CD206 в строме при более крупных опухолях (T3–4) медиана значений в 2 раза ниже, чем при T1–2 (p=0,017), но после поправки на множественные сравнения результат уже не считался значимым (q=0,083). Аналогично, для CD206 в паренхиме у пациентов с коморбидностью медиана в 4 раза выше (p=0,029), однако после поправки статистической значимости нет (q=0,146). Связей с вовлечением лимфоузлов (N-категория), типом операции и курением ни для CD68, ни для CD206 не выявлено.

Корреляции между зонами

В результате корреляционного анализа нами была обнаружена только одна статистически значимая корреляционная связь - выраженная отрицательная корреляция между экспрессиями CD68 в строме и CD206 в паренхиме (ρ=−0,74, p=0.01) в группе долгоживущих пациентов (рис.).

Корреляционные связи по критерию Спирмена между CD68/CD206 в разных зонах опухоли у долгоживущих и короткоживущих пациентов.

Примечание: составлено авторами на основе полученных данных в ходе исследования

Остальные парные корреляции в группе долгоживущих пациентов не имели статистической значимости и по величине колебались от слабых до умеренных: CD68строма-CD206строма ρ=−0,44; CD68паренхима-CD206строма ρ=0,16; CD68паренхима-CD206паренхима ρ=0,53; CD206строма-CD206паренхима ρ=0,53. В группе короткоживущих значимых корреляций не выявлено; коэффициенты находятся в интервале от −0,05 до 0,44, при этом наибольшие значения наблюдаются для пар CD206строма-CD206паренхима (ρ=0,44) и CD68 паренхима-CD206строма (ρ=0,37). Суммарно результаты показывают, что у долгоживущих отмечается чёткая противоположная направленность между CD68 в строме и CD206 в паренхиме, тогда как у короткоживущих преобладает слабая положительная согласованность маркеров без достижения статистической значимости.

Наши результаты подтверждают, что прогноз у пациентов с плоскоклеточным раком лёгкого IIIA стадии определяется не только характеристиками самой опухоли, но и общим состоянием организма и особенностями микроокружения. Иммуногистохимический анализ выявил, что ключевым маркером, ассоциированным с выживаемостью, является CD68 в строме опухоли. У долгоживущих пациентов медиана экспрессии была выше в 1,4 раза (20,0 против 14,0), что сохраняло значение на уровне тенденции даже после поправки на множественные сравнения. Этот результат перекликается с данными Toledo и соавт. [9], показавших, что именно стромальные макрофаги чаще выступают в роли защитного фактора, тогда как их суммарная плотность без учёта локализации менее информативна. В паренхиме опухоли CD68 демонстрировал схожее направление эффекта, но различия оказались статистически незначимыми, видимо, из-за ограниченности выборки. Экспрессия CD206 в обеих зонах значимых различий не выявила. Это подтверждает современные представления о том, что CD206 не является строго специфичным маркером М2-фенотипа, а отражает широкий спектр состояний макрофагов, зависящий от контекста опухолевого микроокружения [10; 11]. Тем не менее корреляционный анализ показал согласованность в инфильтрации различных зон опухоли макрофагами: значимая связь между CD206 в строме и паренхиме, а также ассоциация CD68 и CD206 в паренхиме. Подобные результаты указывают на пространственную связанность различных субпопуляций TAM [12; 13].

Интересным оказалось и сопоставление маркеров с клиническими характеристиками. Выявлена достоверная корреляция между уровнем экспрессии CD68 в строме и наличием коморбидности, а также связь размера опухоли (Т3-4) с экспрессией CD206 в строме. Эти наблюдения позволяют предположить, что системное воспаление и локальные морфологические особенности опухоли могут опосредованно влиять на инфильтрацию TAM, что требует дальнейшего изучения.

По данным корреляционного анализа, картина распределения макрофагов в опухоли принципиально различается у долгоживущих и короткоживущих пациентов. В группе долгоживущих выявлена выраженная обратная связь между CD68 в строме и CD206 в паренхиме опухоли (ρ=−0,74; p=0.01). Наблюдаемая отрицательная корреляция указывает на функциональное многообразие особенностей макрофагов между стромой и паренхимой: чем больше макрофагов в строме в целом, тем меньше М2-подобных макрофагов в паренхиме. Такое пространственное разведение фенотипов согласуется с более благоприятным течением болезни и может отражать стромальный «барьер» для проникновения М2-макрофагов в опухолевые гнёзда или их перепрограммирование в менее иммуносупрессивное состояние на границе опухоли. В той же группе видны умеренно положительные, но статистически незначимые связи CD68паренхима-CD206паренхима (ρ=0,53) и CD206строма-CD206паренхима (ρ=0,53), указывающие, что накопление макрофагов в паренхиме в целом сопряжено с долей макрофагов, имеющих М2-фенотип, однако этот эффект может варьироваться и, вероятно, уступает по влиянию со стороны стромы [14; 15].

В группе короткоживущих пациентов выраженной структуры взаимосвязей не наблюдается: коэффициенты преимущественно слабые и умеренные, положительного направления, без достижения статистической значимости. Такая «согласованность без противопоставления» может отражать более диффузное распределение M2-макрофагов в обеих частях опухоли одновременно, когда увеличение CD206 в строме сопровождается его ростом и в паренхиме, а общее накопление макрофагов не препятствует М2-сдвигу внутри опухоли. Таким образом, иммуносупрессия и ремоделирование тканей поддерживаются во всей опухоли, а не локализуются и не сдерживаются на уровне стромы, что согласуется с менее благоприятным исходом.

В итоге результаты указывают, что для прогноза важна не столько абсолютная плотность макрофагов, сколько пространственная координация их фенотипов между стромой и паренхимой. У долгоживущих прослеживается межгрупповое «разобщение» макрофагального пула стромы и М2-подобного сигнала в паренхиме, тогда как у короткоживущих пациентов проявляется параллельный рост CD206 в обеих зонах.

Заключение

Таким образом, у больных плоскоклеточным раком лёгкого IIIA стадии ключевым прогностическим маркером оказался CD68: более высокая плотность CD68+ макрофагов в строме достоверно ассоциировалась с лучшей общей выживаемостью. При этом корреляционный анализ выявил принципиально важную пространственную закономерность – благоприятный прогноз зависел не столько от количества макрофагов в строме, сколько от пространственной координация их фенотипов между стромой и паренхимой. Среди клинических факторов неблагоприятное влияние на выживаемость продемонстрировали пневмонэктомия и наличие коморбидности. Объединение клинических характеристик с иммуногистохимическими показателями, учитывающими как уровень CD68 в строме, так и характер его связи с CD206 в паренхиме, повышает точность стратификации риска развития и прогрессирования данной патологии.