Введение

Нефрон – основная структурная единица почки, в которой осуществляются процессы, играющие ключевую роль в поддержании гомеостаза [1]. Многие лекарственные препараты могут оказывать повреждающее действие на почечную паренхиму, что приводит к нарушению образования мочи и, как следствие, выраженному белковому и водно-электролитному дисбалансу [2].

К таким медикаментам относится цисплатин – широко применяемый химиотерапевтический препарат, показанный при лечении более чем 10 типов злокачественных опухолей [3, 4]. Он обладает мощной антиканцерогенной активностью: цисплатин связывается с ДНК, что приводит к нарушению функционирования опухолевых клеток и, как следствие, их гибели [5]. Однако у данного препарата есть и ряд нежелательных побочных эффектов, одним из которых является нефротоксичность: по статистике у каждого третьего пациента на фоне применения цисплатина развивается повреждение почек [6]. Это обусловлено склонностью цисплатина накапливаться в почечной паренхиме, вызывая разрушение структурных элементов нефрона [7]. Возникает гиперазотемия, гиперкалиемия, гипопротеинемия, что крайне негативно сказывается на функционировании всех органов и тканей и может привести к развитию летальных осложнений [8].

В современной фармакологии давно идет разработка эффективной сопроводительной терапии для пациентов, получающих цисплатин. В клинической практике был опробован ряд лекарственных средств, доказавших свою цитопротективную активность и способных снизить негативное влияние химиотерапии на функцию почек. К ним относится амифостин [9, 10]. Однако его использование сопровождается рядом побочных эффектов, самым грозным из которых является персистирующая артериальная гипотензия, что в значительной степени ограничивает его применение, особенно у пациентов старческого возраста, перенесших инфаркт миокарда или острое нарушение мозгового кровообращения [11].

Перспективным можно считать поиск новых лекарственных средств растительного происхождения, обладающих достоверным нефропротективным и противовоспалительным потенциалом и лишенных вышеперечисленных недостатков. В группу этих веществ входит природный фитоалексин ресвератрол (транс-ресвератрол). Однозначным преимуществом можно считать весьма обширную базу растений, служащих источником для синтеза ресвератрола [12, 13]. Он содержится в винограде, арахисе, фисташках, какао, а в меньших количествах – в чернике и голубике [14].Именно этим обусловлена его значительная распространенность и низкая стоимость на отечественном фармацевтическом рынке. В ряде исследований уже достоверно подтверждена цитопротективная, антиапоптическая и противовоспалительная активность ресвератрола. Он значительно снижал риск перехода острого повреждения почек в хроническую почечную недостаточность после эпизода ишемии-реперфузии: кратковременное применение ресвератрола повлияло на постишемический восстановительный ответ и ускорило репарацию канальцев за счет снижения окислительного стресса и повреждения митохондрий. Кроме того, ресвератрол воздействовал на воспаление и профибротические сигналы во время дезадаптивного патологического ответа, нормализуя оба процесса [15]. В другом исследовании ресвератрол значительно снизил смертность крыс с сепсисом и облегчил острое повреждение почек, вероятно, за счет снижения стресса эндоплазматического ретикулума и смягчения воспалительной реакции: через 12 ч после перфорации кишечника ресвератрол значительно снизил уровни TNF-α, IL-1β и IL-6 в сыворотке крови у крыс, в то же время повысив уровень IL-10 [16]. Использование ресвератрола при цисплатин-индуцированном остром повреждении почек сопровождалось выраженными дозозависимыми нефропротективными эффектами, проявившимися в снижении уровня креатинина и мочевины плазмы крови, росте скорости клубочковой фильтрации, нормализации фракционной экскреции натрия и улучшении показателя уровня микроциркуляции в паренхиме почек [17]. Все вышеперечисленные исследования подтверждают значительный нефропротективный потенциал ресвератрола при различных патологических состояниях, однако механизм его реализации до сих пор остается неустановленным.

Цель исследования – изучить роль блокады АТФ-зависимых калиевых каналов на ренопротективное действие ресвератрола при моделировании цисплатин-индуцированного острого повреждения почек крыс в эксперименте.

Материал и методы исследования

Исследование выполнено на базе Научно-исследовательского института фармакологии живых систем НИУ «БелГУ» с соблюдением международной конвенции об обращении с лабораторными животными “European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. ETS N123” с учетом протокола “CETS N170” и установленными нормами Российской Федерации. Для участия в эксперименте были отобраны 50 белых лабораторных крыс-самцов линии Wistar массой 250–300 г, прошедших карантинный режим (14 дней) и не имеющих внешних признаков заболеваний. Протокол эксперимента был одобрен местным независимым этическим комитетом Белгородского государственного национального исследовательского университета (Протокол №01-10i/24 от 01.10.2024).

С целью воспроизведения острого почечного повреждения животным внутрибрюшинно вводили цисплатин (Фармасинтез-Норд, Россия) в дозе 5 мг/кг в 1-й и 8-й день эксперимента. В качестве нефропротектора ежедневно внутрижелудочно через зонд давали ресвератрол (Sigma Aldrich, КНР) в дозе 12 мг/кг в виде суспензии в 0,05% растворе карбоксиметилцеллюлозы натрия в течение 14 суток. Блок АТФ-зависимых калиевых каналов осуществлялся с помощью глибенкламида (Манинил, Берлин-Хеми АГ, Германия), который также вводили внутрижелудочно в дозе 5 мг/кг за 30 мин до введения ресвератрола. Цисплатин, ресвератрол и глибенкламид применены в дозировках, которые использовались ранее в ходе исследований отечественными и зарубежными авторами [17–19]. Режим введения обоснован фармакокинетическим профилем препаратов.

Животные были случайным образом разделены на 5 групп по 10 крыс в каждой:

группа 1 – интактные животные;

группа 2 – группа воспроизведения цисплатин-индуцированного острого повреждения почек (животным внутрибрюшинно вводили цисплатин 5 мг/кг);

группа 3 – группа воспроизведения цисплатин-индуцированного острого повреждения почек в сочетании с блоком АТФ-зависимых калиевых каналов (животным вводили цисплатин 5 мг/кг внутрибрюшинно и глибенкламид в дозе 5 мг/кг внутрижелудочно);

группа 4 – группа коррекции цисплатин-индуцированного острого повреждения почек при помощи ресвератрола (животным вводили цисплатин 5 мг/кг внутрибрюшинно и ресвератрол в дозе 12 мг/кг внутрижелудочно);

группа 5 – группа коррекции цисплатин-индуцированного острого повреждения почек при помощи ресвератрола на фоне блока АТФ-зависимых калиевых каналов (животным вводили цисплатин 5 мг/кг внутрибрюшинно, ресвератрол в дозе 12 мг/кг внутрижелудочно и глибенкламид в дозе 5 мг/кг внутрижелудочно).

На время эксперимента крысы находились в пластиковых клетках, по 5 животных в каждой, с обеспечением свободного доступа к пище и воде, на сбалансированном питании для данного вида. За 12 ч до окончания экспериментальной части исследования крыс переводили в ветеринарные метаболические клетки для сбора мочи.

На 14-е сутки после первого введения цисплатина животных погружали в общий наркоз (хлоралгидрат (Sigma-Aldrich, КНР) в дозировке 300мг/кг массы тела внутрибрюшинно) в специализированном помещении со стабильной температурой не менее 25 ºС. Осуществляли фиксацию подопытных на подогреваемом ветеринарном столе, после чего выполняли срединную тораколапаротомию с разрезом по белой линии живота. Аккуратно мобилизовали петли кишечника, вскрывали забрюшинное пространство, с обеих сторон выделяли почечное тело с элементами почечной ножки. Показатели микроциркуляции в почечной паренхиме определяли с помощью лазерного диагностического аппарата «ЛАЗМА СТ» (ООО НПП «ЛАЗМА», Россия), включающего анализаторы периферического кровотока, лимфотока и коферментов ткани «ЛАЗМА-Д», позиционировали периферический датчик в области среднего сегмента почки, не затрагивая зону ренальных сосудов. Значение уровня микроциркуляции выражалось в перфузионных единицах (ПЕд). С целью выполнения биохимического исследования из правого желудочка сердца осуществлялся забор крови. Расчет скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и фракционной экскреции натрия (ФЭН) производился по стандартным формулам. Биохимический анализ крови и мочи выполняли фотоколориметрическим методом с использованием стандартных наборов реактивов на биохимическом анализаторе OLYMPUS AU400 (Diagnostic Systems Group of Olmps America Inc., Япония). Общий анализ мочи с оценкой уровня протеинурии производили на анализаторе Iris iRicell (Beckman Coulter, США) с анализатором физико-химических свойств мочи IRIS iChemVELOCITY.

Для всех данных была применена описательная статистика: данные проверены на нормальность распределения. Определение типа распределения производилось с помощью критерия Шапиро – Уилка. При нормальном распределении подсчитывали среднее значение (M) и стандартную ошибку среднего (m). Равенство дисперсий проверялось критерием Левена. Для анализа межгрупповых различий использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Различия считали статистически значимыми при значениях p<0,05. При выявлении статистически значимых различий (?<0,05) проводили попарные сравнения с помощью теста Тьюки (Tukey HSD). Все расчеты произведены с использованием пакета программ Microsoft Excel 2010 и Statistica 10.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате внутрибрюшинного введения цисплатина зафиксирован трехкратный рост показателей азотемии в сравнении с группой интактных животных, что в совокупности с дисфункцией процессов фильтрации и реабсорбции сигнализирует о развитии острого почечного повреждения (ОПП) согласно современным критериям KDIGO, 2012 (таблица) [20]. Дополнительный блок АТФ-зависимых калиевых каналов при помощи глибенкламида не приводил к достоверному улучшению функции почек. При использовании ресвератрола с целью нефропротекции зарегистрировано снижение показателей азотемии: они были в 1,5 раза ниже, чем в группе моделирования патологии. Однако блок АТФ-зависимых калиевых каналов приводил к достоверному нивелированию его защитного влияния: уровень креатинина достигал 106,4±4,4 мкмоль/л, а мочевины – 18,3±1,6 ммоль/л.

Изучение параметров состояния процессов фильтрации и реабсорбции продемонстрировало схожие тенденции: моделирование острого повреждения почек сопровождалось падением СКФ до 0,08±0,01 мл/мин и ростом ФЭН до 6,13±0,36%. Дополнение к терапии глибенкламида не приводило к улучшению исследуемых показателей (таблица). Ресвератрол способствовал уменьшению негативного влияния цисплатина на функциональную активность почечной ткани: зарегистрирован рост скорости клубочковой фильтрации в 3 раза, сопровождающийся снижением уровня фракционной экскреции натрия в 1,63 раза. По аналогии с динамикой азотемии, блокирование K+АТФ каналов приводило к статистически значимому ухудшению ренопротективного потенциала ресвератрола: СКФ составила 0,14±0,02 мл/мин, а ФЭН – 5,18±0,34%.

В анализах мочи животных интактной группы белок не определялся. Введение цисплатина приводило к нарушению проницаемости сосудистой стенки и развитию острого канальцевого некроза, что подтверждается уровнем протеинурии 1,1±0,2 г/л. Глибенкламид не оказывал влияния на данный показатель (таблица). Коррекция цисплатин-индуцированного острого почечного повреждения с помощью ресвератрола приводила к статистически значимому снижению протеинурии до 0,4±0,1 г/л. Однако нарушение функционирования K+АТФ каналов совместно с введением ресвератрола сопровождалось увеличением концентрации белка в моче, сопоставимой с показателем группы моделирования патологии.

Влияние блока аденозинтрифосфат-зависимых калиевых каналов на показатели, отражающие функцию почек, при коррекции цисплатин-индуцированного

острого повреждения почек с помощью ресвератрола

Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.

x – р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных, y – р < 0,05 в сравнении с группой моделирования цисплатин-индуцированного острого повреждения почек, z – р < 0,05 в сравнении с группой коррекции цисплатин‑индуцированного острого повреждения почек с помощью ресвератрола.

Показатель микроциркуляции в почечной паренхиме в группе интактных животных составил 25,1±0,7 ПЕд. Воспроизведение цисплатин-индуцированного острого почечного повреждения сопровождалось двукратным снижением данного параметра (рисунок). У животных, которым на фоне моделирования патологии дополнительно давали глибенкламид, микроциркуляция не улучшалась. Ренопротекция с помощью ресвератрола способствовала восстановлению микроциркуляции до уровня 18,2±1,1 ПЕд, однако блок K+АТФ каналов тотально нивелировал данный эффект.

Влияние блока аденозинтрифосфат-зависимых калиевых каналов на уровень микроциркуляции в почечной паренхиме при коррекции цисплатин‑индуцированного острого повреждения почек с помощью ресвератрола. x – р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных, y – р < 0,05 в сравнении с группой моделирования цисплатин-индуцированного острого повреждения почек, z – р < 0,05 в сравнении с группой коррекции цисплатин‑индуцированного острого повреждения почек с помощью ресвератрола. Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Изучение роли ионных каналов, особенно АТФ-зависимых калиевых каналов, в реализации защитного потенциала природного фитоалексина ресвератрола сохраняет актуальность и по сегодняшний день. Еще в 2006 г. группой ученых под руководством Aleksandra Novakovic было доказано, что ресвератрол способен оказывать релаксирующее действие на стенку аорты крыс, активируя АТФ-зависимые калиевые каналы [21]. В ходе дальнейших экспериментов выявлено, что ресвератрол оказывает выраженное нейропротективное действие и уменьшает объем повреждения тканей гиппокампа за счет нормализации функционирования K+АТФ каналов мембраны митохондрий [22]. Ресвератрол облегчал ток крови по пупочной вене, снижая риск повреждения плода [23]. Установлено, что ключевую роль в данном процессе играла активация АТФ-зависимых калиевых каналов, так как добавление к терапии глибенкламида субтотально блокировало вазодилатацию. Но не все данные были однозначны. При диагностике кардиопротективных свойств ресвератрола установлено, что совместное его использование с глибенкламидом не приводило к значительному увеличению частоты и длительности эпизодов аритмии, обусловленных ишемией-реперфузией миокарда [24].

Следует помнить, что глибенкламид относится к широко используемым средствам для лечения сахарного диабета 2 типа. Следовательно, попытка нефропротекции с помощью ресвератрола у пациентов, получающих лекарственную противоопухолевую терапию цисплатином и принимающих с целью контроля уровня глюкозы крови производные сульфонилмочевины (глибенкламид и др.), может оказаться неэффективной.

Настоящее исследование имеет ряд ограничений, которые следует учитывать при интерпретации полученных результатов. В работе не выполнялось гистологическое исследование ткани почек, что ограничивает глубину анализа ренопротективного действия. Также мы не оценивали степень прямого влияния глибенкламида на функцию почек у интактных животных, не использовали режим введения с его однократным приемом, так как модель цисплатин-индуцированного острого повреждения почек подразумевает двукратные инъекции цитостатика. Перечисленные ограничения определяют направления для дальнейших исследований, включая расширение дизайна эксперимента.

Заключение

Изучение вклада ионных каналов митохондриальной мембраны в развитие и прогрессирование патологических процессов при токсическом повреждении элементов нефрона находится в центре внимания ученых всего мира. Согласно результатам исследования установлено, что адекватное функционирование АТФ-зависимых калиевых каналов играет важную роль в реализации ренопротекторных свойств ресвератрола при воспроизведении цисплатин-индуцированного острого повреждения почек. Совместное применение глибенкламида с целью блокировки K+АТФ каналов и природного фитоалексина ресвератрола сопровождалось однозначным ухудшением защитных свойств последнего: значительно нарастал уровень азотемии, падала скорость клубочковой фильтрации, усиливалась канальцевая дисфункция, снижался уровень микроциркуляции в почечной паренхиме. Также отмечено, что на фоне прогрессирующей нефропатии возрастал уровень протеинурии.

Дальнейшие исследования помогут в большей степени раскрыть патогенез острого почечного повреждения, вызванного цисплатином, и определить возможные молекулярные мишени для таргетного нефропротективного воздействия.