Введение

Использование в онкологии ингибиторов рецепторных тирозинкиназ (ИТК) привело к увеличению эффективности лечения злокачественных опухолей ряда локализаций и выживаемости онкологических больных, но развитие неизбежной резистентности к такой терапии диктует необходимость поиска и разработки новых молекул. Использование метода молекулярного докинга позволило разработать в Пятигорском медико-фармацевтическом институте ряд соединений на основе пиримидина, способных блокировать тирозинкиназный домен рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) аналогично низкомолекулярному ингибитору гефитиниб (функциональный аналог, низкомолекулярный селективный ингибитор EGFR, производное 4-анилинохиназолина). В предварительных исследованиях in vivo показана противоопухолевая и антиметастатическая активность 4-{2-[2-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-винил]-6-этил-4-оксо-5-фенил-4H-пиримидин-1-ил}-бензсульфамида (6EPSVan) [1], получен патент [2]. Для улучшения растворимости в воде соединение переведено в натриевую соль 6EPSVan-Na, структурная формула представлена в [1]. Также у некоторых синтезированных соединений была показана половая специфичность их действия [3], что особенно интересно в связи с обсуждаемыми актуальными проблемами половых различий в онкологии [4] и взаимодействием между сигнальными путями EGFR и гормонзависимыми путями (через рецепторы эстрогена), приводящим как к стимуляции роста опухоли и метастазирования, так и к адаптивному переключению и формированию резистентности опухоли [5; 6].

Блокировка активации рецепторов, генерирующих первичный сигнал в каскадах сигнализации, низкомолекулярными ИТК нарушает метаболизм опухолевых клеток и способствует их гибели, однако активация программы эпителиально-мезенхимального перехода тесно связана с формированием резистентных фенотипов [7]. Было показано, что индуцируемым ИТК путем может быть путь трансформирующего фактора роста β2 (TGF-β2), ограничивающий эффективность ингибиторов EGFR, при этом перепрограммирование за счет повышенной секреции TGF-β и ряда цитокинов способствовало уклонению от иммунного ответа [8]. На примере люминального рака молочной железы показана связь пути TGF-β и эпителиально-мезенхимального перехода с устойчивостью к антиэстрогенам, обусловленной возможными перекрестными взаимодействиями между путями гормональной сигнализации, EGF/EGFR и TGF-β [9].

Эпителиально-мезенхимальный переход играет ключевую роль в инвазии в лимфатические сосуды и выживании опухолевых клеток в лимфатических узлах (ЛУ), при этом его мощным индуктором является фактор роста TGF-β [10], а ЛУ служат основными центрами роста метастатических клеток, их вторичного распространения в другие ткани и модуляции противоопухолевых иммунных реакций [11]. Иммунная толерантность в регионарных ЛУ частично индуцируется метаболитами, образующимися в самой опухоли in situ, а частично - метаболическими изменениями самих иммунных клеток [12].

Несмотря на ограниченное клиническое использование ингибиторов EGFR (химиорезистентный немелкоклеточный рак легких, HER2+ рак молочной железы, рак носоглотки, колоректальный рак, медуллярный рак щитовидной железы), исследования в этой области обширны, показали не только возможность воздействия ИТК и на другие опухоли, в частности на меланому [13], но и позволили выявить множество интересных явлений. Неожиданной оказалась тесная связь эпидермальной сигнализации и дифференцировки кератиноцитов с прогрессированием меланомы [14]. Активация пути EGFR была обнаружена среди причин резистентности этой агрессивной опухоли к антиBRAF-терапии [15]. Анализ in silico транскрипционного профиля меланомы показал, что для ее более агрессивного фенотипа характерно тесное взаимодействие меланоцитов и эпителия и усиленная активация проопухолевых сигналов [16]. Кроме этого, известно, что основным путем распространения клеток меланомы при метастазировании являются лимфатические сосуды, а метаболические нарушения в опухоли также способствуют метастазированию в лимфатические узлы [12].

Цель исследования – изучить влияние экспериментальной терапии самок мышей с меланомой В16 новым производным пиримидина 6EPSVan-Na на метастазирование и изменение содержания прометастатических факторов роста (факторов роста EGF и TGF-β1) в легких и паховых (ПЛУ) и подмышечных (АЛУ) лимфоузлах.

Материал и методы исследования

В эксперименте использовали 40 самок мышей линии C57BL/6 массой 25-28 г, полученных из филиала «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России» (Московская область). Животных содержали в стандартных условиях вивария. Эксперимент проводили согласно Директиве 2010/63/ЕС и Приказу Минздрава России № 267. Исследование было одобрено Комиссией по биоэтике ФГБУ «НМИЦ онкологии» (протокол № 1/229 от 21.04.2025 г.).

Штамм меланомы В16/F10 получен из НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина (г. Москва). Суспензию жизнеспособных опухолевых клеток перевивали подкожно в подлопаточную область справа 30 мышам, 2-й пассаж in vivo, как описано в [17; 18]. После перевивки животных случайным образом распределили на три группы (n=10 в каждой): контрольная (введение воды для инъекций), 2 группы с экспериментальной терапией – введение нового вещества 6EPSVan-Na и введение препарата гефитиниб (позитивный контроль, демонстрирующий чувствительность опухоли к воздействию на EGFR) в дозе, рассчитанной исходя из рекомендованной дозы для людей в пересчете на мышь. Интактная группа – 10 мышей.

Экспериментальную терапию начинали в день перевивки (раннее профилактически-терапевтическое воздействие) как описано в [17; 18]. Приготовленный ex tempore водный раствор 6EPSVan-Na в дозе 15,0 мг/кг массы мыши вводили 0,1 мл внутримышечно, водный раствор гефитиниба 0,1 мл вводили перорально (в соответствии с его клиническим применением) в дозе 43,9 мг/кг массы мыши. Мышам контрольной группы вводили внутримышечно 0,1 мл воды для инъекций. Терапию закончили на 12-е сутки после перевивки опухоли, на 18-е сутки со дня перевивки произвели эвтаназию всех мышей. При некропсии визуально оценивали макрометастазы в легких и в ЛУ, с последующим гистологическим подтверждением (микроскопия Leica DMLS2, цифровая камера OLYMPUS Camedia C-5050). Из тканей легких, АЛУ и ПЛУ готовили 10%-ные цитозольные фракции, в которых ИФА-методом определяли содержание EGF и TGF-β1 (RayBio, США).

Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 10.0. Результаты представлены в таблицах в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (M±m). С помощью критерия Шапиро - Уилка оценивали нормальность распределений признаков. Значимость различий долей определяли с помощью точного критерия Фишера. Значимость различий в содержании EGF и TGF-β1 определяли с помощью t-теста Стьюдента. Критический уровень значимости р=0,05. При множественных сравнениях использовали поправку Бонферрони: при двух сравнениях критический уровень значимости р = 0,025, при трех – р = 0,017.

Результаты исследования и их обсуждение

В настоящей работе представлены результаты единого патофизиологического экспериментального исследования, частично опубликованные в работах [18] (описание картины метастазирования, гистологии ЛУ и легких) и [17] (содержание EGF в ЛУ). В контрольной группе у 100% мышей при некропсии визуально было отмечено метастатическое поражение ПЛУ и АЛУ, гистологическое исследование показало тотальное поражение клетками меланомы ЛУ. Содержание EGF было выше в 2,6 и 4,7 раза, соответственно, в АЛУ и ПЛУ [17], при этом увеличение содержания TGF-β1 было менее выражено – в среднем в 1,85 раза в ЛУ обеих локализаций, по сравнению с уровнем у интактных мышей (табл.).

Содержание эпидермального EGF и трансформирующего TGF-β1 факторов роста в образцах лимфатических узлов и легких при экспериментальной терапии 6EPSVan-Na и гефитинибом

Примечание: таблица составлена авторами на основе данных, полученных в ходе исследования. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка (M±m). Статистически значимые различия: р1 – по сравнению с показателем в соответствующей ткани у интактных мышей, р2 – по сравнению с показателем в соответствующей ткани в контрольной группе (достигнутый уровень). Критический уровень значимости в случае парных сравнений р = 0,05, при множественных сравнениях: для двух р = 0,025, для трех (сравнение содержания EGF в легких) р1 = 0,017 (поправка Бонферрони).

В группах с терапией поражение АЛУ наблюдалось у 6 (60%) мышей с введением гефитиниба и у 4 (40%) мышей с введением 6EPSVan-Na (соответственно, р=0,0867 и р=0,0108 по сравнению с контролем). Поражение ПЛУ отмечено у всех мышей в группе с гефитинибом (100%) и у 7 (70%) мышей в группе с 6EPSVan-Na (р=0,2105 по сравнению с контролем). При этом одновременное поражение ЛУ обеих зон наблюдалось только у 3 (30%) мышей при терапии 6EPSVan-Na, что статистически значимо ниже частоты в контрольной группе (р=0,0031), и у 6 (60%) мышей при терапии гефитинибом (p=0,0867, по сравнению с контролем). Гистологическое исследование ЛУ после терапии гефитинибом обнаружило признаки гибели клеток меланомы, характерные для апоптоза (фрагментация ядра, конденсирование и распыление хроматина, апоптотические тельца). После терапии 6EPSVan-Na выявлены небольшие скопления опухолевых клеток с признаками деструктивных изменений, позволяющими предположить другой механизм гибели опухолевых клеток – мобилизация клеточных/тканевых элементов защиты [18].

Терапия гефитинибом сопровождалась снижением содержания EGF в 3,2 раза и в 2,8 раза, соответственно в АЛУ и ПЛУ, а терапия 6EPSVan-Na – более выраженным снижением в 4,7 и в 5,8 раза, соответственно в АЛУ и ПЛУ, по сравнению с уровнем в контрольной группе [17]. Содержание TGF-β1 после терапии обоими веществами снижалось: в АЛУ в среднем в 1,8 раза, в ПЛУ в среднем в 1,5 раза по сравнению с уровнем в контрольной группе (табл.). Таким образом, отмечены однонаправленные изменения содержания EGF и TGF-β1 в изученных ЛУ при экспериментальной терапии гефитинибом и новым веществом.

Метастатическое поражение легких, проявившееся единичными/множественными метастазами в обоих легких, обнаружено в контрольной группе у 8 (80%) мышей, микрокартина показала замещение паренхимы легкого клетками меланомы, укрупнение краевых альвеол и деструкцию альвеолярных перегородок, повышенное кровенаполнение легкого, сдавление просветов дыхательных путей [18]. При этом содержание EGF в легких было выше в 11,1 раза, а содержание TGF-β1 выше в 2,6 раза, чем уровень у интактных мышей (табл.).

В отличие от контрольной группы при терапии гефитинибом только у 1 (10%) мыши обнаружены множественные метастазы в левом легком (p=0,0055, по сравнению с контролем), гистологическое исследование области крупного метастаза показало несколько участков роста опухоли с сохранением ее пролиферативной активности, и одновременно на значительных участках легкого картину гибели клеток меланомы аналогично микрокартине в ЛУ [18]. При терапии 6EPSVan-Na ни у одного животного не обнаружено макрометастазов в легких (p=0,0007, по сравнению с контролем), на микрокартине разных участков легких отмечены очаги дистрофически измененных опухолевых клеток с гипохромными ядрами и замещением соединительной тканью, очагов с конгломератами пролиферирующих клеток меланомы не обнаружено. Такой результат терапии сопровождался более низким содержанием обоих изучаемых факторов роста в легких мышей по сравнению с их уровнем в контрольной группе: содержание EGF в 2,6 и в 2,0 раза, содержание TGF-β1 в 2,0 и в 2,3 раза, соответственно при введении гефитиниба и 6EPSVan-Na (табл.). Однако надо отметить, что содержание EGF после терапии в обеих группах оставалось выше уровня в легких интактных мышей в среднем в 4,9 раза, а содержание TGF-β1 не отличалось от него. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что терапия гефитинибом и новым веществом 6EPSVan-Na в целом предотвращает метастатическое поражение легких и сопровождается снижением содержания прометастатических факторов роста EGF и TGF-β1.

Прогрессирование и метастазирование опухолей в значительной мере обусловлены изменениями в цитокиновом профиле опухолевого микроокружения. Установлено, что EGF стимулирует миграцию и инвазию опухолевых клеток через аутокринно/паракринную регуляцию EGFR-сигнализации. Увеличение продукции этого фактора роста является одним из механизмов усиления активности EGFR-сигнализации и, как выявлено, связано с проинвазивным фенотипом меланомы и обуславливается ее значительной гетерогенностью [16; 19; 20]. В исследовании Lee K. H. и соавт. (2021) обнаружена положительная экспрессия EGFR в опухоли при меланоме с отдаленными метастазами, коррелировавшая с низкой выживаемостью больных мужского пола, имевших опухоль без изъязвления, с толщиной по Бреслоу ≤4 мм, при этом отмечалась тенденция к более частому метастазированию в легкие и в головной мозг, чем у больных с отрицательной экспрессией рецептора [19].

Кроме этого, показано, что EGF и EGFR-сигнализация играют важную роль в лимфангиогенезе и метастазировании меланомы в ЛУ, влияя на инвазивный потенциал клеток меланомы [21; 22].

На этапе развившейся опухоли TGF-β оказывает проинвазивное и прометастатическое действие. Его увеличенная продукция модулирует иммунные изменения в микроокружении опухоли, способствуя иммуносупрессии, участвует в ремоделировании внеклеточного матрикса, стимуляции ангио- и лимфангиогенеза, в индукции эпителиально-мезенхимального перехода, в целом стимулируя прогрессирование [23; 24]. Было обнаружено, что этот цитокин также участвует в прогрессировании и инвазии не только эпителиальных опухолей, но и меланомы [24; 25].

С этими представлениями согласуется показанное в нашем исследовании значительно более высокое содержание EGF и TGF-β1 в метастатически пораженных ЛУ и легких у мышей контрольной группы – с подкожно растущей меланомой без воздействия. Вырабатываемый опухолевыми и стромальными клетками в большом количестве TGF-β, наряду с другими иммуносупрессивными цитокинами, вызывает иммуносупрессию противоопухолевого ответа (активация регуляторных Т-клеток, подавление цитотоксических Т- и NK-клеток, поляризация макрофагов и нейтрофилов) и формирование толерогенной среды не только в микроокружении первичной опухоли, но и в иммунном микроокружении сайтов метастазирования, в том числе в ЛУ и легких, поддерживая жизнеспособность метастатических клеток, способствуя устойчивому метастазированию меланомы [23; 26]. Непосредственно с этим связана и активация лимфангиогенеза как через TGF-β-зависимые сигнальные пути (Smad-зависимая и Smad-независимая передача сигналов) и повышение уровня сосудистоэндотелиального фактора роста С (VEGF-C), так и через EGF-зависимую сигнализацию, т. к. лимфатическая система играет значительную роль в метастазировании меланомы [11; 23].

Также установлено, что TGF-β является ключевым регулятором инвазивности меланомы, индуцируя ее пластичность и переход к мезенхимальному фенотипу [27]. Обнаружены синергетические взаимодействия сигнального пути TGF-β с путем EGF/EGFR, в результате чего образуются сильно взаимосвязанные сети, вероятно, обусловливающие противоречивость эффектов TGF-β, однако механизмы этого недостаточно изучены [28; 29].

С существованием такой взаимосвязи согласуются и наши результаты, показавшие, что при терапии гефитинибом и веществом 6EPSVan-Na – соединениями, ингибирующими EGFR, отмечается более низкое содержание обоих факторов роста в ЛУ и легких в отличие от мышей в контрольной группе, сопровождавшее уменьшение количества макрометастазов и отсутствие активно растущих метастатических очагов в легких, а также картину гибели опухолевых клеток в лимфоузлах в группах с экспериментальной терапией. К сожалению, нам не удалось найти информацию об аналогичных экспериментальных исследованиях in vivo, однако в работе Zhao Y. и соавт. (2018) была показана положительная корреляция экспрессии TGF‐β и EGFR в тканях рака молочной железы, а также in vitro продемонстрировано влияние повышенного уровня TGF-β на усиление экспрессии EGFR и связанное усиление миграции и инвазии клеток рака молочной железы [30]. В другой работе in vitro была продемонстрирована способность ингибиторов EGFR уменьшать индуцированную TGF-β1 диссоциацию кластеров циркулирующих опухолевых клеток, экспрессирующих EGFR, хотя не обнаружено при этом повышения уровня EGF [31]. Авторы предположили, что ингибиторы EGFR могут быть эффективными препаратами для замедления прогрессирования опухоли в связи с их влиянием на распространение опухолевых клеток даже при отсутствии специфических мутаций в гене EGFR.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что экспериментальная терапия новым веществом 6EPSVan-Na у самок мышей с меланомой В16 приводила к снижению частоты метастазирования в легкие аналогично действию гефитиниба, а также к уменьшению частоты метастатического поражения АЛУ и частоты синхронного поражения АЛУ и ПЛУ. Наблюдаемое антиметастатическое действие экспериментальной терапии, возможно, связано с изменениями в содержании прометастатических факторов роста – EGF и TGF-β1 – как в изученных лимфоузлах, так и в легких. Эти изменения были однонаправленны и в целом сопоставимы по величине при терапии обоими веществами.

Настоящее исследование имеет ряд ограничений: использование относительно небольшого количества экспериментальных животных одного пола, только одной дозы нового вещества и только на одном сроке метастазирования, невозможность прямого сравнения эффективности терапии новым соединением и референтным препаратом гефитиниб, что обусловлено различными путями их введения (что к тому же не являлось целью исследования), отсутствие данных об экспрессии рецепторов соответствующих факторов роста в изученных тканях, а также результатов оценки in vitro продукции EGF и TGF-β1 клетками меланомы после воздействия на них изучаемыми соединениями. Однако, несмотря на это, полученные результаты демонстрируют перспективность дальнейшего изучения антиметастатического эффекта соединения 6EPSVan-Na и его механизмов.