Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Проблема загрязнения окружающей среды нефтью особенно актуальна для Сибири (в частности, Ямало-Ненецкого и Ханты-Мансийского автономных округов), где располагается основной нефтегазоносный район России.

Значительная часть Пуровского и Надымского районов Ямало-Ненецкого автономного округа (ЯНАО) занята природными ландшафтами различной степени нарушенности вследствие обустройства месторождений и размещения вспомогательных объектов, городской инфраструктуры, вахтовых поселений.

В природно-климатических условиях ЯНАО в результате нефтяных разливов изменяются тепловые и физические свойства почвы, нарушается почвенный режим промерзания - оттаивания, чрезвычайно медленно протекает самовосстановление экосистем, что провоцирует ускорение эрозионных процессов. Отмечается большая неоднородность распределения нефтяных компонентов в почвах разных участков нефтепромыслов, что зависит от физических и химических свойств конкретных почв, качества и состава поступившей нефти. В результате этого условия самоочищение окружающей среды от токсичных органических веществ техногенного происхождения в ландшафтных зонах и областях различны [4]. Опасность остаточного накопления нефтепродуктов возрастает с юга на север.

 Самоочищение почво-грунтов и водоемов от нефтезагрязнений с помощью эндогенной углеводородокисляющей микробиоты происходит с небольшой скоростью и лимитируется неблагоприятными факторами (низкими среднегодовыми температурами, недостатком аэрации, отсутствием необходимого количества биогенных элементов и др.). Кроме того, характерной чертой северных экосистем является небольшая мощность гумусового горизонта, низкая биологическая активность почв, относительная обедненность видового состава растений, микроорганизмов и почвенных животных. Поэтому процессы биодеструкции нефтепродуктов и других загрязнителей заторможены и носят кратковременный характер [1, 4].

В местах проложенных трубопроводов разливы нефти повторяются регулярно. Временной мерой к устранению видимого нефтяного загрязнения является засыпка песком или торфом, являющаяся впоследствии не эффективной, поскольку нефть, поднимаемая грунтовой или дождевой водой, все равно всплывает на поверхность. При засыпке загрязнения торфом происходит захоронение и консервация тяжелых фракций нефти в нижележащих обводненных слоях торфа, где наблюдаются низкие температуры и нехватка свободного кислорода. При этом деструкции нефти аборигенной микробиотой почти не происходит, и отсутствуют физико-химические факторы разложения (солнечное излучение, ферменты микроорганизмов, растений и окислительные химические соединения) [2].

На данный момент известно множество видов микроорганизмов-нефтедеструкторов, которые входят в состав биопрепаратов, широко применяющихся для ликвидации аварийных разливов нефти и нефтепродуктов. Не вызывает сомнения, что с помощью микробиоты происходит полное разложение всех фракций нефти, в том числе и парафинов (твердых алканов). В связи с этим, существует реальная необходимость и возможность успешного проведения поисковой работы по выделению, изучению способностей и потенциала деструкции парафинов природными микроорганизмами - деструкторами нефти и нефтепродуктов.

Целью работы являлось исследование деструкции предельных углеводородов микроорганизмами, выделенными из северных районов нефтедобычи, при пониженных положительных температурах.

Материал и методы исследования

В районах нефтедобычи ЯНАО были взяты образцы воды, почвы, техногенного грунта и отсыпки для изучения микробного разнообразия из следующих экосистем: сосняк зеленомошный, верховое болото (мохово-кустарничковое), верховое болото (осоково-пушициевое), сосново-березовый смешанный лес, песчаная отсыпка. Образцы с загрязненных нефтью территорий включали в себя торф, воду болот, донные отложения, грунтовую воду, песок, почву верхних, средних и граничащих с мерзлотой горизонтов.

Для выделения штаммов-нефтедеструкторов образцы природных субстратов инкубировали в жидкой селективной питательной среде 8Е (г/л): (NH₄)₂HPO₄ - 1.5; KH₂PO₄ - 0.7; MgSO₄ x 7H₂О - 0.8; NaCl - 0.5; pH 7.2  с добавлением нефти по весу (до 2 %) на качалке при температуре +8-10 ºС; затем полученные накопительные культуры переносили на агаризованную среду для получения чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов.

Морфологические признаки полученных изолятов-деструкторов изучали с помощью световой микроскопии живых и окрашенных клеток с использованием микроскопа Carl Zeiss Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия).

Оценку способности микроорганизмов к деструкции нефти осуществляли в жидкой питательной среде с добавлением нефти месторождений Западной Сибири в качестве единственного источника углерода. Биоэмульгирующие и биодеградирующие способности микроорганизмов оценивали визуально и с помощью газовой хроматографии. Первичная биодеградация нефти в пробирках оценивалась по следующим параметрам: разбиванию поверхностной пленки нефти, помутнению питательной среды за счет роста биомассы, образованию однородной эмульсии нефти в среде, газообразованию.

Выбор эффективных штаммов-деструкторов осуществляли по результатам хроматографических исследований и способности к росту и утилизации нефти при температуре 4-8º С.  

Чистые культуры микроорганизмов-деструкторов исследовали на наличие ферментативных свойств: протеолитической, амилолитической, желатиназной, каталазной, цитратной, оксидазной активности, способности к сбраживанию углеводов. Идентификацию штаммов бактерий осуществляли по определителю Берджи [6].

Косвенные признаки патогенности выявляли после постановки теста на наличие гемолизиса на кровяном агаре, фибринолитических и плазмокоагулирующих свойств с цитратной кроличьей плазмой. 

Эксперименты с деструкцией нефти в почве  производились в пластиковых контейнерах при температурах 8 ºС и 4 ºС в течение 28 сут. Содержание нефти в почве составляло 10 % по весу. При этом на 1 г почвы вносилось 10⁶ КОЕ чистой культуры. 

Количественное определение содержания предельных углеводородов в образцах проводили методом капиллярной газовой хроматографии на приборе Varian 3600, оснащенном колонкой J&W Scientific DB-5, 30 м. х 0.22 мм, инжектором с делением потока (темп. 320 ºС), пламенно-ионизационным детектором (темп. 335 ºС), системой регистрации и обработки хроматографических данных (ChromStar, Bruker). В ходе анализа программировали изменение температуры колонки: 50 ºС - 2 мин , 50 ºС - 320 ºС - 15 ºС /мин , 320 ºС - 5 мин. Отнесение хроматографических пиков выполняли по времени удерживания с использованием калибровочного образца Boiling Point Calibration Sample #1, «ULTRA Scientific, Inc.», США.

Результаты исследования и их обсуждение

Из природных загрязненных нефтью субстратов были выделены 13 чистых культур микроорганизмов, обладающих способностью к активному росту на селективных питательных средах с нефтью.

На основе анализа литературных данных можно сделать вывод, что наиболее распространенными в загрязненных нефтью местообитаниях являются бактерии, а именно представители родов Rhodococcus, Arthrobacter, Acinetobacter. Micrococcus, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus [5, 7, 8, 9, 10]. В хронически загрязненных экосистемах безусловным доминантом являются родококки. Углеводородокисляющие дрожжи и мицелиальные грибы в загрязненных водных экосистемах занимают второстепенное место.

Таксономическая принадлежность природных изолятов, наиболее эффективно утилизировавших нефть по результатам визуального контроля, определена к родам Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Bacillus sp., Enterobacter sp., что согласуется с литературными данными. У этих штаммов были исследованы морфологические, биохимические и физиологические свойства (табл. 1). Косвенные признаки патогенности не выявлены.

Таблица 1. Биохимические свойства штаммов-деструкторов нефтепродуктов

Выделенные тринадцать наиболее эффективных штаммов-деструкторов были внесены в емкости с загрязненной высокопарафинистой нефтью почвой с целью выяснения степени ее деструкции, а также разложения н-алканов. В результате было показано, что все штаммы деградируют за 4 недели до 69,4-89,9 % нефти. Количество предельных углеводородов твердой фракции (С17-С39) при этом снижалось на 60,7-84,9 % (табл. 2). Лучшие результаты по деструкции твердых алканов были показаны у штаммов 2, 4, 6, 12, 13, которые были объединены в микробную ассоциацию ДТА-1.

Таблица 2. Остаточное количество предельных углеводородов в образцах почвы после культивирования со штаммами микроорганизмов

Полученная ассоциация из 5 штаммов ДТА-1 была изучена на способность к деструкции нефтяной фракции твердых алканов при низких положительных температурах. Степень деструкции твердых алканов С17-С39 ассоциацией ДТА-1 составила 89,8 %.

Для определения влияния температуры на скорость и степень деструкции твердых алканов штаммами микроорганизмов-деструкторов нефти проведены сравнительные эксперименты при разных температурах (+4 ºС и +8 ºС). В целом, нужно отметить, что температура культивирования влияет только на скорость деструкции. При температуре +4 ºС степень деструкции твердых алканов на 5-11 % ниже по сравнению со степенью деструкции при температуре +8 ºС.

Заключение

Проведенные эксперименты показали наличие высокоэффективной нефтеразлагающей аборигенной микробиоты в местах разливов нефти в ЯНАО. Выделенные микроорганизмы способны к деструкции многих компонентов нефти, в т.ч. твердых алканов. Наиболее эффективные биодеструкторы были объединены в ассоциацию бактериальных штаммов ДТА-1, которая может быть рекомендована для разработки препарата, направленного для очистки загрязненных нефтью территорий в условиях севера, а также обработки цистерн и др. емкостей, длительное время используемых для хранения нефтепродуктов.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (ГК № 16.512.11.2160).

Рецензенты:

• Беднаржевский С.С., д.т.н., профессор, заведующий кафедрой «Безопасность жизнедеятельности» Сургутского государственного университета,. г. Сургут.
• Загребельный С.Н., д.б.н., профессор кафедры химии окружающей среды Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», г. Новосибирск.