Структуры лишайниковых полисахаридов и хитозана имеют ряд общих черт, вероятно, потому, что лишайники - это симбиоз грибов и водорослей, а известно, что наиболее распространенная кристаллографическая модификация хитина (α-хитин) встречается в панцирях членистоногих и гифах некоторых грибов. Известно, что, хитозан - линейный аминополисахарид. Его макромолекулы состоят из случайно связанных β-(1-4) D-глюкоз-аминовых звеньев и N-ацетил-D-глюкозамина, который образуется при деацетилировании хитина. Мономером хитина является N-ацетил-1,4-β-D-глюкопиранозамин [10]. В гифах лишайников обнаружены хитин и полисахариды лихенаны. Их количество доходит до 45-50% на сухое вещество. Лихенаны - β-D-глюканы, содержащие β-1,4 (до 73%) и β-1,3 (до 27%) связанные остатки D-глюкозы, а также водорастворимые изолихенаны, построенные из α-1,3 и α-1,4 связанных остатков D-глюкозы, а также смесь гетерополисахаридов, построенных из остатков D-маннозы, D-галактозы, D-глюкозы и гексуроновой кислоты [10]. Причем часть остатков D-глюкозы лихенанов также связана с аминогруппами [4].
Целью работы является проведение сравнительного анализа структуры, свойств и некоторых областей применения лишайниковых амино-β-олигосахаридов и хитозана.
Материалы и методы исследования
Производство олигомеров хитозана ведется кислотно-щелочным способом или методом ферментативного гидролиза с последующей ультрафильтрацией. Расщепить хитин и хитозан до N-ацетил-D-глюкозамина и D-глюкозамина можно под действием микробных ферментов, таких как хитиназы и хитобиазы [10].
Процессы дезацетилирования хитина с образованием хитозана и его олигомеров могут происходить и в твердом состоянии при механическом воздействии [1]. Олигомеры лихенана также можно получать экстракцией кипящей водой с 2%-ной щелочью [7] и ферментативным гидролизом.
Результаты и обсуждение
Благодаря своему строению (большое количество свободных положительно заряженных аминогрупп, гидроксильных групп, образующих водородные связи, гидрофобных групп), хитозан обладает высокой хелатирующей способностью в отношении ионов различных металлов, в том числе радиоактивных изотопов и токсичных элементов, токсинов, жиров и жирорастворимых соединений. Хитозан способен снижать уровень холестерина, оказывать иммуномодулирующее действие (аналогично действию 1,3-глюкана, но более слабое), при этом он не только не является аллергеном, но и ингибирует процессы воспаления. Ввиду схожей химической структуры олигомеров хитозана (ОХ) с компонентами хрящевой и соединительной тканей человека, прежде всего со структурой олигосахаридных компонентов гликокаликса клеточных мембран, они могут быть отнесены к «сигнальным» молекулярным веществам, способным запускать иммунные реакции, обладающим высокой противоопухолевой активностью, стимулирующим рост и размножение нормальных клеток [10].
Известен также широкий спектр фармакологической активности и лишайниковых лихенанов. Они обладают антигипоксическим, отхаркивающим, противовоспалительным, иммунотропным, энтеросорбирующим, гепатопротекторным, гиполипидемическим, противоопухолевым, общеукрепляющим действием [7]. Причем максимальной антиопухолевой и иммуномодулирующей (антикомплементарной) активностью обладают β-1,3-олиго-D-глюканы, со средней степенью разветвления (присоединения по 1-6-связям остатков D-глюкозы): 1:3, 1:2, 1:24 [7], а по своей структуре они ещё более близки к олигосахаридным компонентам гликокаликса.
Вместе с тем сырьевая доступность слоевищ лишайников существенно выше, чем панцирей членистоногих, поэтому в нашей работе, во-первых, были апробированы новые физико-химические биотехнологии получения лишайниковых амино-β-олигосахаридов (ЛА-β-ОС; обработка диоксидом углерода в состоянии сверхкритической жидкости, механохимические биотехнологии). Во-вторых, исследованы свойства ЛА-β-ОС и оценены области их возможного применения.
Создан БАД «Ягель» - водно-спиртовый экстракт слоевищ лишайников рода Cladonia, предварительно обработанных СО2 в состоянии сверхкритической жидкости [8].
Основные активные вещества - амино-β-олигосахариды (до 3мг/мл), образующиеся из амино-β-полисахаридов при обработке их водой в среде сверхкритического СО2. Содержит также комплекс веществ антиоксидантного действия: орселиновые, леканоровые, грифоровые, хиастовые кислоты и хиноны; природные антибиотики - усниновые кислоты и их производные. Содержание ЛА-β-ОС определяли как хроматомасс-спектрометрическим методом, так и стандартным нингидриновым титрованием раствора веществ, остающихся на нанофильтре (размер пор 5 нм) при пропускании через него БАД «Ягель», предварительно обработанной амилазой до полного гидролиза a-олиго- и a-дисахаридов.
Разработана также механохимическая биотехнология получения высокоактивных твёрдофазных супрамолекулярных комплексов, состоящих из универсального «активного наполнителя» - ЛА-β-ОС, получаемых при механохимической активации амино-β-поли-сахаридов, и фармакона любой природы (лишайниковые кислоты антибиотического действия, известные препараты антибиотического, иммуномодуляторного, адаптогенного, цитостатического действия, витаминно-микроэлементные комплексы и т.д.) - препараты серии «Ягель-ТМ» [4]. Особенностью данной биотехнологии является то, что «активный наполнитель» образуется при механохимической активации части ЛА-β-ОС одновременно с образованием супрамолекулярных комплексов с фармаконом. Соответственно, вся совокупность механохимических превращений в твердой фазе в реакторе проточного типа проходит в одну стадию, поэтому весь процесс очень технологичен.
Сравнение ИК-спектров порошков ягеля грубого помола и механоактивированного, а также анализ водорастворимых углеводов (по методу восстанавливающих концов) в экстрактах слоевищ лишайников после вышеуказанных обработок подтвердили, что при механохимической активации происходит частичное расщепление b-гликозидных связей в лишайниковых b-полисахаридах с образованием водорастворимых, легко усвояемых ЛА-β-ОС, концентрация которых увеличивалась при двухминутной механоактивации в 7,3 раза.
С помощью сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии показано, что механохимическая активация слоевищ лишайников и их композитов с природными физиологически активными веществами (ФАВ) приводит к образованию наноразмерных частиц в твердой фазе [3].
Благодаря наноразмерам и особенностям структуры b-олигосахариды и их супрамолекулярные комплексы с ФАВ хорошо растворяются в воде, легко всасываются в желудочно-кишечном тракте и транспортируются через клеточные мембраны, выступая в качестве «активного транспортного средства» для фармаконов, обеспечивая тем самым их высокую усвояемость (почти 100%-ное всасывание и транспорт в клетки без потери биоактивности фармакона) и биоактивность. Вследствие этого биоэффективная доза в ряде направлений применения таких комплексов может быть снижена в 5-10 раз, что особенно важно в таких областях, как онкология, радиопротекция, спортивная медицина и др.
Слоевища лишайников содержат лишайниковые кислоты антибактериального действия, поэтому получаемые механоактивированные препараты a priori обладают также естественной стерильностью. Во внутренних средах организма ЛА-b-ОС не гидролизуются и после «разгрузки от фармакона» за счет активных функциональных групп способны связывать эндотоксины (напр., обуславливающие тяжесть протекания воспалительных процессов, аллергических реакций и аутоиммунных заболеваний, включая бронхиальную астму; алкогольные токсины - альдегиды, кетоны; избытки холестерина) и экзотоксины (тяжелые металлы, радионуклиды, канцерогены и др.), эффективно выводя их из организма и оказывая, таким образом, детоксикационное действие внутренних сред организма (кровь, лимфа, меж- и внутриклеточные жидкости).
В модельном эксперименте показано, что адсорбционная активность биопрепарата «Ягель-ТМ» по катионам Со2+ повышается после механоактивации в 3,6 раза, а по метиленовому синему (аналог эндотоксинов малой и средней молекулярной массы, образующихся при воспалениях любой этиологии и обуславливающих, в значительной степени, тяжесть воспалительного процесса) - в 1,6 раза [5].
Показано, что введение БАД «Ягель» в водочные изделия в соотношении 1:100 в целях детоксикации, а также профилактики алкогольных патологий позволяет снизить в 2÷3 раза токсическое действие алкоголя при полном сохранении эйфорического эффекта; более чем в 20 раз уменьшить постинтоксикационный эффект, в 5,6 раза уменьшить скорость формирования наркоманической алкогольной зависимости [8].
За счет близости структуры b-олигосахаридов структуре олигосахаридов гликокаликса внешнего слоя клеточных мембран 3-4 недельный приём БАД «Ягель» повышает секрецию инсулина β-клетками панкреаса в 1,8-1,9 раза [11], соответственно снижается в 1,8-1,9 раза уровень сахара и на 20-40% содержание гликозилированного гемоглобина при одновременном снижении доли липопротеидов низкой плотности на 18¸37% в крови у больных сахарным диабетом II типа и b-холестерина у страдающих атеросклерозом [6].
Антитромбиновая активность препарата «Ягель» показана в Гематологическом научном центре РАМН (г. Москва). Наряду с выявленной антиатерогенной активностью это позволяет рекомендовать препарат «Ягель» в целях профилактики и купирования последствий тяжелейших сосудистых патологий, включая инсульты и инфаркты.
Создан механохимический композит, состоящий из ЛА-β-ОС («активный наполнитель») стандартного препарата «витаминно-микроэлементного комплекса» (ВМЭК, «фар-макон») в соотношении 20:1. Исследование его физиологической активности показало повышение в 1,9-2,5 раза резистентности (характеристик, связанных с выносливостью, двигательной и исследовательской активностью) животного организма к действию физических нагрузок и экстремальных факторов различной природы по сравнению со смесью грубого помола, за счет большей биодоступности ВМЭК и детоксикационной функции «активного наполнителя» (содержание лактата в мышцах при одной и той же нагрузке снизилось в 1,5 раза). При этом изменение массы в контрольной и экспериментальных группах не выявили достоверных отличий, т.е. исследуемые препараты не способствуют наращиванию мышечной массы и не обладают анаболическими свойствами.
Аналогичные по характеру эффекты, но ещё более выраженные в количественном отношении (в 2,5-5,2 раза), были получены при совместной механоактивации слоевищ лишайников с тканями некоторых лекарственных растений: корней и корневищ родиолы розовой, листьев и верхних побегов рододендрона золотистого в соотношении 10:1. Созданные механохимические композиты могут быть использованы в качестве лечебно-профилактического средства для повышения физической активности, выносливости, ускорения восстановления после физической нагрузки спортсменов и работоспособности людей, ведущих активный образ жизни, проживающих в экологически неблагоприятных регионах, а также в ветеринарии.
По аналогичной методологии создан препарат антибиотического действия НАНОЯГЕЛЬ-М, антибактериальная активность которого повышена в 8-10 раз по сравнению с исходным фармаконом - стандартным препаратом антибактериального действия. Это позволило снизить дозу вводимого антибиотика в 5-8 раз при повышении терапевтической активности препарата в 1,4-1,6 раза [3].
Испытания биопрепарата «Ягель-М», проведенные на лабораторных животных, инфицированных лекарственно устойчивыми штаммами микобактерий (туберкулеза) показали очень высокую эффективность: при 100%-ной летальности в контрольной группе, в группе животных, принимающих препарат «Ягель-М», летальность равна 0, более того, животные за время эксперимента (2,5 месяца) прибавили в весе на 20%. Причем на такой препарат антибактериального действия не развивается реакция привыкания соответствующих микробиологических штаммов [9].
Показано, что механоактивация слоевищ лишайников позволяет значительно снизить дозировку ягелевого сырья как пищевой добавки в хлебобулочные изделия с 1-3% до 0,2-0,5%, при этом пищевая ценность, качество хлебобулочных изделий значительно возрастают. Благодаря этому разработан способ повышения качества хлебобулочных изделий и срока их хранения без черствления и плеснения (без введения химиоконсервантов) в 2,5-3,0 раза за счет введения при хлебопечении милликоличеств биопрепарата «Ягель-ТМ». Результатом является также обогащение хлебобулочных изделий эссенциальными микроэлементами, негормональными ФАВ, повышение степени их усвояемости и улучшение физико-химических показателей хлеба. При этом, кроме того что появляется возможность выпускать продукты с повышенным сроком годности, решается также задача выпуска продуктов питания оздоровительной направленности [2].
Заключение
Все вышеизложенное позволяет предложить лишайниковые амино-β-олиго-сахариды, получаемые с помощью новых физико-химических биотехнологий, с учетом их большего сырьевого потенциала, в качестве альтернативы олигосахаридам хитозана в некоторых направлениях использования.
Рецензенты
- Борисова Н.В., д.м.н., зам. директора по учебной работе Медицинского института СВФУ, г. Якутск.
- Нюкканов А.Н., д.б.н., профессор кафедры зоогигиены и внутренних болезней ФГБОУ ВПО «Якутская государственная сельскохозяйственная академия», г. Якутск.