На территории Средней полосы Европейской части России произрастает 9 видов рода тимьян (Thymus L.), которые заготовители собирают как равноценные под названием «Трава чабреца» [4]. Виды данного рода содержат эфирные масла, фенольные соединения, тритерпеновые соединения и отличаются друг от друга по количественному и качественному составу указанных групп биологически активных веществ [6]. При этом, при заготовке травы чабреца не учитываются различия между отдельными видами, которые могут иметь различный состав как эфирного масла, так и фенольных и тритерпеновых соединений и различную направленность действия.
Целью работы явилось изучение веществ первичного биосинтеза травы тимьяна блошиного.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования служила сухая воздушно-измельченная трава тимьяна блошиного, заготовленная в 2011 г. в Брянской области в фазу цветения.
Для выделения полисахаридного комплекса воздушно-сухое измельченное сырье предварительно обрабатывали 70%-ным спиртом этиловым для удаления полифенольных соединений, затем водой экстрагировали водорастворимые полисахариды.
Воздушно-сухой шрот экстрагировали водой в соотношении 1:20 к массе сырья при нагревании до 95 ○С в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Повторное извлечение полисахаридов проводили дважды водой в соотношении 1:10. Растительный материал отделяли центрифугированием, и объединенные экстракты упаривали до 1/5 первоначального объема. Полисахариды осаждали тройным объемом 96%-ного спирта этилового при комнатной температуре. Выпавший плотный осадок полисахаридов отделяли, промывали 70%-ным спиртом этиловым, ацетоном. Полученные водорастворимые полисахаридные комплексы лиофильно высушивали [2].
Из шрота, оставшегося после получения водорастворимых полисахаридов, выделяли пектиновые вещества экстракцией смесью 0,5%-ных растворов кислоты щавелевой и оксалата аммония (1:1) в соотношении 1:20 при 80-85 ○С в течение 2 часов. Повторное извлечение проводили дважды в соотношении 1:10. Объединенные извлечения концентрировали и осаждали пятикратным объемом 96%-ного спирта этилового. Полученные осадки отфильтровывали, промывали спиртом этиловым, высушивали и взвешивали [2].
Шрот, оставшийся после выделения пектиновых веществ, заливали пятикратным объемом 10%-ного водного раствора натрия гидроксида и оставляли при комнатной температуре на 12 часов. Затем отфильтровывали, к полученному фильтрату прибавляли два объема кислоты уксусной. Образовавшийся осадок отфильтровывали через фильтр. На фильтре получился осадок гемицеллюлозы А в виде зеленовато-коричневой массы. К фильтрату добавляли двукратный объем 96%-ного спирта этилового для осаждения гемицеллюлозы Б. Полученный осадок отфильтровывали через фильтр, промывали спиртом, высушивали [2].
Для установления моносахаридного состава водорастворимых полисахаридов (ВРПС), пектиновых веществ (ПВ), гемицеллюлозы А и Б (Гц А, Гц Б) проводили их гидролиз 2Н кислотой серной. Навески веществ (0,05) помещали в ампулу емкостью 5-10 мл, прибавляли 2,5 мл раствора кислоты серной, запаивали ампулы и гидролизовали при температуре 100-105 ○С в течение 6 часов (для ВРПС), 24 часов (для ПВ) и 48 часов (для Гц А, Гц Б). Гидролизат нейтрализовали бария карбонатом по универсальному индикатору до нейтральной реакции, отфильтровывали и осаждали спиртом этиловым 96%-ным. Образовавшийся осадок обрабатывали катионитом КУ - 2 до кислой реакции. Разделение и идентификацию нейтральных моносахаридов проводили методом нисходящей хроматографии на бумаге в системе растворителей н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) параллельно со стандартными образцами сахаров. Кислые моносахара разделяли в системе этилацетат - кислота муравьиная - вода - кислота уксусная (18:1:4:3). Проявитель - анилинфталат, температура проявления 100 ○С, длительность проявления 10-15 минут [2].
Качественное обнаружение аминокислот проводили в водном извлечении с помощью нингидриновой реакции и хроматографией в тонком слое сорбента [1; 3]. Для этого 5,0 г воздушно-сухого измельченного сырья заливали 50 мл дистиллированной воды и нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Извлечение фильтровали, сырье заливали снова 50 мл воды и операцию повторяли. Водные извлечения, полученные после трехкратной экстракции, объединяли, упаривали под вакуумом до 25 мл и использовали для проведения качественной реакции и хроматографического анализа. При качественном анализе смешивали равные объемы исследуемого извлечения и 0,1% свежеприготовленного раствора нингидрина и осторожно нагревали.
Хроматографический анализ проводили в тонком слое сорбента. 0,03-0,05 мл полученных извлечений наносили на подготовленные хроматографические пластинки «Силуфол» и хроматографировали в системе растворителей: 96%-ный спирт этиловый: концентрированный аммиак в соотношении (16:4,5) параллельно с достоверными образцами аминокислот. Хроматограммы высушивали на воздухе, обрабатывали их 0,2%-ным спиртовым раствором нингидрина и нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-105 °С в течение нескольких минут.
Для более детального изучения содержания свободных аминокислот использовали аминокислотный анализатор марки LKB 4151 «Альфа плюс» [1]. Связанные аминокислоты определяли после кислотного гидролиза.
Определение содержание макро- и микроэлементов в сырье проводили с использованием эмиссионного спектрального анализа [1].
Результаты исследования и их обсуждение. В результате проведенных исследований из травы тимьяна блошиного впервые были выделены полисахариды. Выход водорастворимого полисахаридного комплекса составил 5,80%, который представляет собой аморфное вещество светло-коричневого цвета, без запаха, хорошо растворим в воде, практически нерастворим в органических растворителях, дает положительные реакции осаждения со спиртом, ацетоном, реакцию Феллинга после кислотного гидролиза, а также образует оранжевое окрашивание с раствором основного свинца ацетата и зеленоватый осадок с меди сульфатом.
Выход пектиновых веществ составил 10,60% от массы воздушно-сухого сырья. Пектиновые вещества представляют собой порошок светло-кремового цвета, хорошо растворимы в воде с образованием вязкого раствора (рН 1%-ного водного раствора 3-4). Водные растворы пектиновых веществ осаждаются 1%-ным раствором алюминия сульфата с образованием пектинов [2]. Выход гемицеллюлозы А составил 14,97%, а гемицеллюлозы Б - 4,36% от массы воздушно-сухого сырья.
Методом хроматографии на бумаге параллельно с достоверными образцами сахаров в исследуемом ВРПС идентифицировали глюкозу, галактозу, арабинозу, рамнозу, ксилозу, глюкуроновую и галактуроновую кислоты, с преобладанием галактозы и арабинозы. В выделенных ПВ преобладающей является галактуроновая кислота, кроме того, в них обнаружены и нейтральные моносахариды - галактоза, арабиноза, ксилоза и рамноза.
В гидролизате ГЦ А и ГЦ Б обнаружены галактоза, арабиноза, глюкоза, ксилоза. По величине пятен и интенсивности их окраски преобладающим моносахаридом является ксилоза, что указывает на наличие полисахаридов типа ксиланов.
Результаты качественного анализа аминокислот позволили установить их наличие в траве тимьяна блошиного. При хроматографическом анализе аминокислоты проявлялись в виде красно-фиолетовых пятен.
Аминокислотный состав травы тимьяна блошиного представлен аспарагиновой кислотой, треонином, серином, глутаминовой кислотой, пролином, цистеином, глицином, аланином, валином, метионином, изолейцином, лейцином, тирозином, фенилаланином, гистидином, лизином, аргинином. Суммарное содержание свободных аминокислот в траве тимьяна блошиного составляет 0,70 мг/100 мг, содержание связанных аминокислот - 2,145 мг/100 мг (таблица 1).
Таблица 1 - Содержание и состав аминокислот травы тимьяна блошиного, мг/100 мг в пересчете на абсолютно сухое сырье
|
Наименование аминокислоты |
Содержание свободных аминокислот |
Содержание связных аминокислот |
|
Аспарагиновая кислота |
0,040 |
0,070 |
|
Треонин* |
0,020 |
0,050 |
|
Серин |
0,020 |
0,045 |
|
Глутаминовая кислота |
- |
0,150 |
|
Пролин |
- |
0,450 |
|
Цистеин |
0,120 |
Следы |
|
Глицин |
0,050 |
0,150 |
|
Аланин |
0,120 |
0,130 |
|
Валин* |
0,020 |
0,220 |
|
Метионин* |
0,010 |
0,045 |
|
Изолейцин* |
0,010 |
0,035 |
|
Лейцин* |
0,070 |
0,270 |
|
Тирозин |
0,040 |
0,080 |
|
Фенилаланин* |
0,040 |
0,150 |
|
Гистидин |
0,020 |
0,060 |
|
Лизин* |
0,050 |
0,080 |
|
Аргинин |
0,060 |
0,170 |
|
Сумма аминокислот |
0,700 |
2,145 |
|
* - незаменимые аминокислоты. |
||
Проведенный анализ минерального состава показал, что наибольшая концентрация среди биоэлементов в траве тимьяна блошиного наблюдается у фосфора (0,07824%), марганца (0,01956%), бария (0,02934%), а наименьшая у молибдена (0,00000978%) и висмута (0,00000978%).
Выводы. Из травы тимьяна блошиного выделены полисахариды: водорастворимый полисахаридный комплекс, пектиновые вещества и гемицеллюлоза А и Б, изучен их качественный состав.
Изучен качественный и количественный аминокислотный и минеральный состав.
Рецензенты
- Хабаров А.А., д.фарм.н., профессор кафедры общей химии ГБОУ ВПО «КГМУ», г. Курск.
- Дроздова И.Л., д.фарм.н., профессор кафедры фармакологии и ботаники ГБОУ ВПО «КГМУ», г. Курск.