Введение. В настоящее время интерес, проявляемый к изучению флавоноидов специалистами разных направлений, существенно возрос. Причина этого заключается в их значительной биологической роли в живых системах и разнонаправленном фармакологическом действии. Для флавоноидов достоверно установлены такие фармакологические эффекты, как иммуностимулирующий, противоопухолевый, кардио-, гепато- и геропротекторный, антитромбоцитный, противоаллергический, противовирусный, гипохолестеринемический, капилляроукрепляющий, эстрогенный [5].

Доминирующее действие флавоноидов - антирадикальное, связанное с наличием в их структуре фенольных гидроксилов, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях радикального типа. В этих реакциях флавоноиды выступают в роли восстановителей - доноров электронов по отношению к какому-либо радикальному агенту, переходя в свою окисленную форму - флавоксильный радикал [3].

Для анализа флавоноидов в объектах растительного происхождения применяют разнообразные инструментальные методы, в особенности хроматографические. В меньшей степени используется масс-спектрометрия, а именно матрично-активированная лазерная десорбционная ионизация (MALDI), метод, использующийся в основном для анализа высокомолекулярных соединений [1; 3; 4].

Метод MALDI нас привлёк по причине того, что позволяет анализировать смеси веществ без их предварительного разделения.

В связи с этим нами поставлена цель настоящего исследования - установление возможности применения метода матрично-активированного лазерной десорбционной ионизации (MALDI) для определения флавоноидного состава цветков клевера лугового.

В качестве объекта исследования был взят образец цветков клевера лугового, являющегося представителем местной флоры, широко распространенным, легко культивируемым в качестве кормового [2].

Для реализации поставленной цели основной задачей исследования явилось изучение флавоноидного состава выбранного объекта.

Для выделения флавоноидов нами использована схема, согласно которой сырьё - цветки клевера экстрагировали пятикратно 96%-ным спиртом этиловым в аппарате Сокслета.

Полученную сумму сгущали на ротационном вакуум-испарителе ИР-1. Остаток разбавляли водой и отстаивали в холодильнике в течение суток. Выпавший осадок липофильных веществ отделяли под вакуумом, и фильтрат оставляли в холодильнике для просветления. Отстоявшуюся жидкость фракционировали хлороформом и этилацетатом.

Полученные фракции упаривали под вакуумом, таким образом, получены хлороформная фракция Х-1 и этилацетатная - Э-1.

Фракцию Э-1 переосаждали хлороформом и отстаивали в холодильнике. Выпавший жёлтый кристаллический осадок отделяли центрифугированием.

Осадок очищали методом препаративной тонкослойной хроматографии в тонком слое силикагеля на пластинках Silufol. Элюирование осуществляли в системе «этилацетат - уксусная кислота - муравьиная кислота - вода» в соотношениях (10:1:1:2,6). В результате в центральной части хроматограммы наблюдалась широкая полоса ярко-жёлтого цвета (Ф-1) соответствующая гликозиду, в верхней части хроматограммы локализовалась узкая полоса тёмного цвета (Ф-2) агликона. Слой силикагеля у полученной полосы снимали с хроматограммы и элюировали спиртом этиловым 96%-ным.

Элюат спектрофотометрировали на УФ-спектрофотометре СФ-56. УФ-спектр вещества Ф-1 в области 220-400 нм имел максимум поглощения 264 и 355 нм и два плеча 303 и 305 нм, что характерно для флавонолов.

Для установления расположения гидроксильных групп в структуре соединения использовали шифт-реактивы. При использовании шифт-пробы с алюминия хлоридом наблюдался батохромный сдвиг обеих полос поглощения - первой с 355 до 398 нм, второй с 264 до 273 нм, что свидетельствует о свободной гидроксильной группе в 5 положении.

Добавление нескольких капель соляной кислоты не привело к гипсохромному сдвигу, что говорит об отсутствии о-дигидроксигруппировки в кольце В. При добавлении ацетата натрия наблюдалась батохромия первой полосы поглощения, что свидетельствует о свободной гидроксильной группе в положении 7.

Регистрацию масс-спектров проводили на приборе масс-спектрометр «Autoflex II» «MALDI TOF/TOF» фирмы Bruker Daltonics производства Германии. Предварительно анализируемые пробы в количестве по 0,5 μl с помощью дозатора наносили на мишень «MTP 384 target plate matt steel TF», высушивали и сверху наносили каплю матрицы. В качестве матрицы использовали α-цианокоричную кислоту, регистрацию спектров вели с помощью программы Flex Control, обработку данных осуществляли в программе Flex Analis, в отражённом режиме при положительной полярности (reflective positive).

В масс-спектре изучаемого вещества наблюдался наиболее интенсивный пик иона m/z = 287,259 - соответствующий кемпферолу, и менее выраженный пик иона m/z = 471,117 - отвечающий гликозидной структуре (рис. 1).

Рис. 1. Масс-спектр вещества Ф-1 из цветков клевера лугового.

Приведённые выше данные позволили охарактеризовать вещество как кемпферол-3-глюкозид или трифолин.

Маточник после отделения осадка исследовали на наличие других флавоноидов методом масс-спектрометрии. Присутствие характеристических пиков молекулярных ионов с m/z = 303,312 и 487,247 соответствует моногликозиду кверцетина в натриевой форме, а m/z =317,301 и 501,255 моногликозиду изорамнетина (рис. 2).

Рис. 2. Масс-спектр этилацетатной фракции цветков клевера лугового.

В хлороформной фракции обнаружены агликоны изофлавоноидов. Её предварительно упаривали досуха, растворяли в спирте этиловом и регистрировали УФ-спектры. В УФ-спектре в диапазоне 220-400 нм наблюдался один максимум поглощения при λ = 262 нм, что характерно для изофлавоноидов группы генистеина (рис. 3).

Рис. 3. УФ-спектр хлороформной фракции цветков клевера лугового.

 

При масс-спектрометрическом исследовании полученной фракции наблюдалось присутствие трёх интенсивных пиков ионов m/z = 269,357; 285,348 и 272,407 - соответствующих агликонам: формононетину, биоханину и генистеину (рис. 4).

 

Рис. 4. Масс-спектр хлороформной фракции цветков клевера лугового.

Таким образом, в ходе настоящего исследования установлено, что использование метода матрично-активированной лазерной десорбционной ионизации (MALDI) позволило предварительно охарактеризовать состав смесей флавоноидов в цветках клевера лугового без предварительного их разделения на отдельные компоненты.

Рецензенты

• Дроздова И.Л., д.ф.н., профессор кафедры фармакогнозии и ботаники, декан фармацевтического факультета Курского государственного университета, г. Курск.
• Бубенчикова В.Н., д.ф.н., профессор, заведующая кафедрой фармакогнозии и ботаники Курского государственного медицинского университета, г. Курск.