Ранее на кафедре фармакологии Казанского ГМУ были изучены препараты класса фосфорилацетогидразидов, обладающие широким спектром психотропной активности; детально исследованы препараты «КАПАХ» и «Фосфабензид», разработаны методики контроля их качества [4,5].
Продолжением исследований биологической активности фосфорилацетогидразидов стало изучение нового биологически активного вещества - натриевой соли ацетилгидразино-4-хлорфенилфосфиновой кислоты (Na-CPAH), синтезированного на кафедре органической химии Казанского НИТУ.
Фармакологами КазГМУ установлена низкая токсичность, высокая антидепрессивная и мнемотропная активность Na-CPAH, превосходящая активности препаратов «КАПАХ» и «Фосфабензид» [3].
Для введения в медицинскую практику нового БАВ, кроме параметров эффективность и безопасность, необходимо также разработать надежные методики контроля качества. В современном фармацевтическом анализе органических лекарственных веществ широко применяются физико-химические методы, такие как УФ-, ИК-спектроскопия, позволяющие проводить идентификацию лекарственных веществ, оценивать чистоту и количественное содержание по фармакологически активной части молекулы [1].
Цель настоящего исследования - разработать оптимальные методики качественного и количественного определения БАВ Na-CPAH.
Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовалось БАВ Na-CPAH. По внешнему виду это аморфный порошок кремового цвета, без запаха и вкуса; легко растворим в воде, практически не растворим в эфире, хлороформе и спирте.
Подлинность вещества Na-CPAH устанавливали физико-химическими методами: ИК - и УФ-спектрофотометрией, рекомендованными ГФ XII.
ИК-спектры снимали в таблетках калия бромида на ИК-спектрометре фирмы "Bruker" VECTOR 22 (рис. 1).
УФ-спектры поглощения снимали на двухлучевом регистрирующем спектрофотометре Lambda 25 («Perkin Elmer», США) с использованием сервисного пакета программ «Perkin Elmer UV WinLab 5.2.0.0646 / Lambda 25 1.27»."
Помимо физико-химических методов изучены окислительно-восстановительные реакции Na-CPAH по гидразидной группе. В качестве редокс-реактивов на Na-CPAH нами исследованы растворы йода, калия перманганата и серебра нитрата. Для объективной оценки, исследования проводились параллельно с испытуемым и контрольным растворами. Определение чувствительности реакций обнаружения Na-CPAH проводили визуально и выражали в мкг/мл вещества в пробе.
Количественное содержание Na-CPAH в субстанции определяли методом прямой УФ-спектрофотометрии на регистрирующем спектрофотометре Lambda 25 («Perkin Elmer», США).
Статистическая обработка результатов количественного определения проводилась по методике, рекомендованной ГФ XI [2] .
Результаты исследования и их обсуждения. ИК-спектр Na-CPAH (рис.1) имеет характеристические полосы поглощения следующих групп: фосфорильная Р=О (1191 см -1), карбонильная С=О (1642 ,1454см-1 ), гидразидная NHNH2 (3392 см-1 ).
Рис. 1. ИК-спектр Na-CPAH
УФ-спектр поглощения 0,02 % раствора субстанции в области от 250 до 300 нм имеет максимумы поглощения при 263,270 и 275 нм, что объясняется электронными переходами в ароматических кольцах (рис. 2).
Рис. 2. УФ-спектр водного раствора Na-CPAH
Качественные реакции (на гидразидную группу) показали, что исследуемое БАВ обесцвечивает раствор йода, перманганата калия в кислой среде, а с аммиачным раствором нитрата серебра при нагревании образует серый осадок серебра в виде серебряного зеркала.
Реакция с перманганатом калия, как наиболее чувствительная, рекомендована нами в качестве реакции подлинности.
Методика: К 0,02 г субстанции прибавляют 1 мл воды и 0,25 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3 %. При прибавлении нескольких капель 0,1 % раствора перманганата калия происходит обесцвечивание раствора.
Чувствительность реакции 50 мкг/мл
Для количественного анализа был выбран максимум поглощения при длине волны 263±2 нм (рис. 2). Изучение зависимости между оптической плотностью и концентрацией раствора Na-CPAH показало, что она имеет линейный характер, значение оптической плотности укладываются в интервал 0,2 - 0,8 мг/мл (табл.1), значение коэффициента корреляции составляет 0,9947, что позволяет использовать данный градуировочный график для количественного определения Na-CPAH (рис. 2).
Таблица 1. Определение удельного показателя поглощения водных растворов Na-CPAH
С, % |
Aср. |
|
Метрологические Характеристики |
0,01 |
0,18103 |
18,1 |
f=6 =19,06 S2=1,05 S=1,025 S =0,39 R=2,05 Q(95%,7)=0,51 ε=±1,14 % |
0,015 |
0,2687 |
17,91 |
|
0,02 |
0,36134 |
18,06 |
|
0,025 |
0,4791 |
19,16 |
|
0,03 |
0,6021 |
20,07 |
|
0,035 |
0,7003 |
20,01 |
|
0,04 |
0,80622 |
20,15
|
На основе полученных результатов рассчитывали значения удельного показателя поглощения Na-CPAH (табл. 1). Рассчитанный удельный показатель поглощения водных растворов Na-CPAH при длине волны 263±1 нм равен 19,07
Рис. 3. Определение подчиненности раствора Na-CPAH в водных растворах основному закону светопоглощения
Количественное определение Na-CPAH проводили с помощью калибровочного графика, удельного показателя поглощения и сравнением оптических плотностей стандартного и анализируемого растворов.
В качестве стандарта использовали 0,02 % водный раствор Na-CPAH с известным содержанием основного вещества. Оценку чистоты Na-CPAH и идентификацию образующихся при его синтезе побочных продуктов проводили методом тонкослойной хроматографии с использованием стандартных пластинок «Sorbfil- UV-254».
Для объективной оценки исследования проводились параллельно с испытуемым и контрольным растворами.
Количественное определение. Методика:
Испытуемый раствор. Около 0,02 г субстанции (точная навеска), помещают в мерную колбу объемом 100 мл, растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора тем же растворителем до метки.
Стандартный раствор. Около 0,02 г субстанции (точная навеска) стандартного образца Na-CPAH, помещают в мерную колбу объемом 100 мл, растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора тем же растворителем до метки.
Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора и стандартного раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при 263 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Таблица 2. Результаты количественного определения Na-CPAH методом УФ-спектрофотометрии
№ п/п |
Взято, г |
Найдено, % |
||
По удельному показателю поглощения |
По раствору стандартного образца |
По калибровочной кривой |
||
1. |
0,0185 |
99,16 |
99,08 |
99,36 |
2. |
0,0190 |
99,23 |
99,21 |
99,21 |
3. |
0,0195 |
99,12 |
99,68 |
98,73 |
4. |
0,02 |
99,43 |
99,39 |
98,9 |
5 |
0,0205 |
99,36 |
99,18 |
99,4 |
ε |
±0,7% |
±0,74% |
±0,92% |
Согласно полученным данным с равной эффективностью можно использовать все методы расчета концентрации исследуемого вещества. Относительная погрешность определения составляет ± 0,92 %.
При оценке воспроизводимости результатов количественного содержания Na-CPAH методом УФ-спектрофотометрии на основе разработанной нами методики установлено, что выборка признана однородной и не отягощенной грубой ошибкой. Метрологические характеристики представлены в таблице 3.
Таким образом, разработаны методики идентификации нового БАВ с выраженной нейротропной активностью Na-CPAH с применением качественных и количественных методов анализа. Установлена возможность применения метода УФ-спектрофотометрии для количественной оценки субстанции Na-CPAH и разработана методика.
Таблица 3. Данные статистической обработки полученных результатов
N |
f |
|
S2 |
S |
S |
R |
Q(P,n) |
ε |
5 |
4 |
99,26 |
0,02 |
0,14 |
0,06 |
0,2 |
Q(95%,5)=0,64 |
±0,4% |
5 |
4 |
99,3 |
0,05 |
0,23 |
0,1 |
0,1 |
Q(95%,5)=0,64 |
±0,64% |
5 |
4 |
99,08 |
0,06 |
0,26 |
0,1 |
0,24 |
Q(95%,5)=0,64 |
±0,72% |
Выводы
- Изучены физико-химические свойства нового БАВ Na-CPAH с нейротропной активностью, на основе которых установлена его подлинность (УФ-, ИК-спектры, цветные реакции с перманганатом калия).
- Разработана методика количественного определения Na-CPAH методом УФ-спектрофотометрии.
Рецензенты:
Егорова С. Н., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой ФПК и ППС ГБОУ ВПО «КазГМУ», г. Казань.
Камаева С. С., д.м.н., доцент кафедры технологии лекарств ГБОУ ВПО «КазГМУ», г. Казань.