Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Введение

Тромбоциты активно участвуют в процессах воспаления, регенерации и репарации поврежденных тканей, реализации врожденного и адаптивного иммунитета [3]. При повреждении тканей тромбоциты является инициирующими клетками, так как вовлекаются в процесс в течение нескольких секунд-минут. Тромбоцитарно-эндотелиальные (адгезия) и тромбоцитарно-тромбоцитарные (агрегация) взаимодействия имеют ключевое значение в защитных реакциях организма в связи с участием в гемостазе, регуляции тонуса сосудов, процессов пролиферации и репарации. Это реализуется за счет наличия в тромбоцитах иммуноглобулинов IgG, IgМ, IgА, IgЕ, альбумина, АДФ, гистамина, серотонина, факторов роста и других веществ. Взаимодействия тромбоцитов друг с другом, эндотелиоцитами, а также адгезивными экстрацеллюлярными белками обеспечиваются поверхностными рецепторами - мембранными гликопротеинами. Эти взаимодействия на аутокринном и паракринном уровне стимулируются тромбином, АДФ, ФАТ, тромбоксаном А2, ингибируются - простациклином, оксидом азота (II). Для понимания фундаментальных аспектов регуляции гомеостаза и разработки перспективных направлений фармакологической коррекции привлекают интерес эндогенные регуляторы функциональной активности тромбоцитов: церулоплазмин, альфа-1-кислый гликопротин и др., концентрация которых в плазме поддерживается на постоянном уровне в физиологических условиях и изменяется при различной патологии [1; 2]. В последние годы объектом пристального внимания исследователей биомедицинского профиля являются плейотропные эффекты эритропоэтина (ЭПО). ЭПО отвечает за пролиферацию, дифференцировку и угнетение апоптоза в бурст- и колониеобразующих единицах гранулоцитарно-моноцитарно-мегакариоцитарно-эритроцитарных, при этом главным эффектом ЭПО является снижение скорости апоптоза эритроидных клеток-предшественниц в костном мозге. Рецепторы к ЭПО обнаружены на клетках нервной ткани, яичников и яичек, матки, гладкомышечных клетках сосудов, кардиомиоцитах, эндотелиоцитах, эпителии легких и почечных канальцев [9]. Эти клетки способны не только экспрессировать рецепторы ЭПО, некоторые из них могут синтезировать ЭПО. Наличие таких потенций позволяет предположить, что ЭПО выполняет ряд функций, отличных от гемопоэтической. Ранее нами продемонстрированы нейропротекторные свойства ЭПО, его влияние на аффективный и психофизиологический статус, коагуляционный гемостаз, функциональное состояние эндотелиоцитов, связанные с антиапоптическим, антигипоксическим, дезинтоксикационным и антиоксидантным действием [4-6]. Остаются малоизученными эффекты ЭПО на количество и функциональное состояние тромбоцитов периферической крови.

Цель исследования - исследовать влияние эритропоэтина на количественный состав и функциональную активность тромбоцитов периферической крови.

Материалы и методы исследования

Для реализации поставленной цели использована кровь больных людей с хронической почечной недостаточностью (ХПН) - пациентов отделения диализа ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница». ХПН является удобной моделью для исследования эффектов ЭПО, т.к. пери- и тубулярные клетки почек являются основным местом синтеза эндогенного ЭПО. При ХПН продукция эритропоэтина критически снижается, что позволяет оценивать изменения функциональной активности тромбоцитов в этих условиях, а также в условиях введения экзогенного ЭПО. Проведено краткосрочное, открытое, проспективное клиническое исследование гемостазиологических эффектов ЭПО у больных ХПН, находящихся на гемодиализе. Первоначально обследовано 160 больных с терминальной стадией ХПН в возрасте от 22 до 72 лет (средний возраст 45,5 года), получающих гемодиализную терапию на аппаратах «Искусственная почка» 4008S/BIBAG фирмы Fresenius (Германия) 3 раза в неделю в течение 4 часов. После рандомизации в исследование включено 62 больных, из них 29 женщин и 33 мужчины. Отбор больных для исследования проводили в соответствии с критериями включения и исключения. Критерий включения: больные с терминальной стадией ХПН. Критерии исключения: 1) декомпенсация со стороны сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной систем; 2) наличие в анамнезе туберкулеза, венерических заболеваний, гепатита, ВИЧ-инфекции, онкологических заболеваний; 3) острые нарушения церебрального кровообращения; 4) острый воспалительный процесс; 5) беременность; 6) уровень гемоглобина ниже 60 г/л. Группа 1 - контроль (n=25) представлена клинически здоровыми людьми - добровольцами, не имеющими соматической патологии и сопоставимыми по возрасту и полу с основными группами. Группа 2 - больные ХПН, не принимающие ЭПО до процедуры гемодиализа (n=24). Группа 3 - больные ХПН, не принимающие ЭПО после процедуры гемодиализа (n=24). Группа 4 - больные ХПН, принимающие ЭПО до процедуры гемодиализа (n=38). Группа 5 - больные ХПН, принимающие ЭПО после процедуры гемодиализа (n=38). Кровь для исследований у больных 2-5 групп забиралась из артериального колена артерио-венозной фистулы. Больные 4 и 5 группы получали ЭПО в составе препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, Roche, Швейцария) 2 раза в неделю внутривенно в разовой дозе  2000-4000 МЕ в течение 2 месяцев, суммарная доза составила около 40000 МЕ. На гематологическом анализаторе фирмы Orphee (Япония) волюмометрическим методом определяли количество и ширину распределения по размеру тромбоцитов. АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов исследовали на двухканальном лазерном анализаторе LA-230 (Россия), регистрировали амплитуду (%), время (мин) и скорость агрегации (%/мин). Уровень NOх оценивали с помощью реакции Griess, результат выражали в мкмоль/л. Для определения активности фактора фон Виллебранда (vWF) использована его способность вызывать агглютинацию тромбоцитов в присутствии ристоцетина (НПО «Ренам», Москва), результат выражали в %. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 6.0. Для анализа нормальности распределения данных применяли критерий Шапиро-Уилка, проверки гипотез о равенстве генеральных дисперсий - критерий Левена. Проверку статистических гипотез проводили с использованием непараметрических критериев (U-критерий Манна-Уитни, WW - критерий Вальда-Вольфовитца). При множественных сравнениях вводили поправку Бонферрони. Для выявления связи между параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена (R). Отличия считали статистически значимыми при р≤0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

У больных ХПН независимо от времени взятия крови - до или после процедуры диализа - в периферической крови снижается количество тромбоцитов в среднем на 50% (табл. 1).

Таблица 1 - Влияние ЭПО на количественный состав и морфологические признаки тромбоцитов периферической крови у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)

*  - значимые различия (р<0.05)  с группой 1,

#  - с группой 2,

& - с группой 3,

^  - с группой 4.

Показатель тромбокрита, который отражает долю объема цельной крови, занимаемую тромбоцитами, также значимо снижается, в среднем на 30%. Заслуживает внимания факт уменьшения среднего объема тромбоцитов, хотя он и остается в пределах референсных значений (7 -11 фл). Показатель ширины распределения тромбоцитов по объему отражает гетерогенность популяции тромбоцитов  по размерам (степень анизоцитоза), т.е. говорит о том, насколько сильно тромбоциты отличаются между собой по размерам. В норме показатель составляет 10-20%, более жесткие нормативы представлены интервалом 15-17%. Снижение ширины распределения тромбоцитов у больных ХПН указывает на гомогенность размеров тромбоцитов в периферической крови. Механизм развития тромбоцитопении может быть связан с угнетением образования тромбоцитов в костном мозге, ускорением тромбоцитодиэреза при снижении продолжительности жизни или увеличении потребления кровяных пластинок в ходе тромбообразования. Снижение среднего объема тромбоцитов у больных ХПН может свидетельствовать в пользу угнетения мегакариоцито- и/или тромбоцитопоэза, поскольку чем крупнее тромбоциты, тем они моложе. В то же время снижение молодых форм тромбоцитов может быть связано с их ускоренным разрушением в кровотоке. Известно, что недавно вышедшие в кровоток тромбоциты содержат большее количество РНК, которую можно выявить путем окраски. В группе больных ХПН, находящихся на гемодиализе, процент тромбоцитов, содержащих РНК, был достоверно снижен по сравнению с группами на перитонеальном диализе и на консервативной терапии. После процедуры диализа данный показатель снижался еще больше. Одним из механизмов усиленного тромбоцитодиэреза у больных ХПН, находящихся на постоянной гемодиализной терапии, может быть развитие аутоиммунитета и продукция антитромбоцитарных антител, связанная с применением гепарина.

Далее проведены исследования функциональной активности тромбоцитов. Известно, что одной из центральных функций тромбоцитов является их агрегация: наступающая после адгезии активация тромбоцитов завершается синтезом продуктов арахидоновой кислоты, изменением свойств мембраны и высвобождением содержимого гранул, вследствие этого кровяные пластинки могут взаимодействовать друг с другом и образовывать тромбоцитарный тромб. При нарушении активации тромбоцитов, замедлении или прекращения адгезии и агрегации, усилении дезагрегации возникают тяжелые геморрагии. В качестве индуктора агрегации была использована динатриевая соль АДФ, т.к. АДФ является основным физиологическим проагрегантным фактором. Показатели АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, представлены в табл. 2. У больных ХПН до процедуры гемодиализа интегральный показатель, скорость агрегации, снижается в среднем на 53,7% по сравнению с нормальными величинами в контрольной группе. Замедление скорости обусловлено укорочением процесса и снижением амплитуды агрегации, при этом вклад амплитуды (снижение в среднем на 62%) более значим, чем времени агрегации (снижение в среднем на 19%), что может рассматриваться как угнетение способности тромбоцитов к взаимодействию друг с другом с формированием трехмерных агрегатов. После процедуры гемодиализа скорость агрегации тромбоцитов еще больше замедлялась, составляя всего лишь 30% от нормальных средних значений, что было связано с преимущественным падением амплитуды процесса. Полагаем, что длительный, в течение нескольких часов контакт тромбоцитов с мембраной диализатора  и поверхностью экстракорпорального контура приводит к усугублению их функциональной несостоятельности.

Таблица 2 - Влияние ЭПО на показатели агрегации тромбоцитов у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)

*  - значимые различия (р<0.05)  с группой 1,

#  - с группой 2,

^  - с группой 4.

Установлено, что в сыворотке у больных ХПН до процедуры гемодиализа повышено содержание конечных стабильных метаболитов NO, нитритов и нитратов, в сумме в среднем на 34%, при этом наблюдается преимущественный прирост нитритов (+62%) по сравнению с нитратами (+26%) (табл. 3). После процедуры гемодиализа концентрация продуктов NO в сыворотке снижается до нормальных значений. Заслуживает внимания анализ индивидуальной реактивности у больных ХПН по показателям нитроксидергических процессов. Действительно, до процедуры гемодиализа при совокупном увеличении концентрации в сыворотке продуктов NO из 24 больных у 10 отмечена тенденция к их уменьшению, дифференцированно в большей степени это отразилось на динамике содержания стабильных нитратов (10 больных) по сравнению с нитритами (4 больных). После процедуры диализа при совокупном уменьшении концентрации в сыворотке продуктов NO из 24 больных у 8 наблюдается их увеличение, при этом увеличивалось содержание нитритов у 12 больных, нитратов - у 6 больных. Таким образом, отмечена гетерогенность содержания метаболитов оксида азота (II) в сыворотке у больных ХПН до и после процедуры гемодиализа, выраженность которой возрастает после диализной процедуры, когда у 50% больных наблюдается прирост содержания нитритов. Такие индивидуальные особенности уровня метаболитов NO могут быть обусловлены неоднозначными эффектами диализной процедуры.

Таблица 3 - Влияние ЭПО на содержание стабильных метаболитов оксида азота (II) в сыворотке и активность фактора Виллебранда в плазме у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)

*  - значимые различия (р<0.05)  с группой 1,

#  - с группой 2.

У больных ХПН повышена активность фактора фон Виллебранда в плазме, процедура гемодиализа не оказывает значимого влияния на этот показатель (табл. 3). Механизм повышения активности фактора Виллебранда остается не вполне ясным, возможно, это компенсаторный ответ на снижение функциональной способности тромбоцитов. Установлено, что активность vWF значимо нарастает по мере увеличения концентрации продуктов NOх в сыворотке, связь между показателями сильная, положительная (R=0,75; р<0,05). Данный факт может быть связан с тем, что пероксинитрит (ONOO-), образующийся из оксида азота (II) в условиях оксидативного стресса при уремии, напрямую повышает экспрессию фактора Вилебранда, а также тромбомодулина, Р- и Е-селектина, ICAM-1, VCAM-1, различных факторов роста и хемокинов через активацию оксидантчувствительного фактора транскрипции NF-κB в эндотелиоцитах.

Применение ЭПО у больных ХПН приводит к увеличению тромбокрита, количества тромбоцитов, среднего объема тромбоцитов (табл. 1). Механизм влияния ЭПО на количество тромбоцитов в кровотоке может быть связан с несколькими факторами. Во-первых, нельзя исключить прямой тромбоцитопоэтический эффект ЭПО, реализуемый на уровне мегакариоцитопоэза и/или тромбоцитопоэза. ЭПО отвечает за пролиферацию, дифференцировку и угнетение апоптоза, в том числе в колониеобразующих единицах гранулоцитарно-моноцитарно-мегакариоцитарно-эритроцитарных, т.е. оказывает свой эффект не только на предшественников эритроидного, но и мегакариоцитарного ряда. Нельзя исключить также известные антиапоптические эффекты ЭПО, реализуемые на уровне мегакариоцитарного ростка. В пользу данного предположения свидетельствует увеличение среднего объема тромбоцитов, циркулирующих в кровотоке у больных ХПН. На модели трансгенных мышей с «выключением» гена ЭПО была установлена роль внутриклеточных путей сигнализации в мегакариоците, инициируемых ЭПО [7]. Кроме того, возможен косвенный тромбоцитопоэтический эффект ЭПО, осуществляемый через коррекцию анемии и улучшение кислородообеспечения костного мозга. Во-вторых, увеличение количества тромбоцитов под влиянием ЭПО может быть связано с уменьшением скорости и интенсивности тромбоцитодиэреза, возможно, за счет снижения выраженности азотемии, нормализации процессов свободно-радикального окисления. Однако для подтверждения последнего предположения требуется проведение дополнительных исследований. Снижение количества тромбоцитов, их объема и степени анизоцитоза после диализа подтверждает факт негативной селекции молодых форм тромбоцитов при контакте с диализной мембраной. Дело в том, что активирующее воздействие диализатора на тромбоциты приводит к элиминации из кровотока наиболее активных и функционально полноценных клеток.

На следующем этапе нами проведено исследование влияния ЭПО на функциональную активность тромбоцитов у больных ХПН. Установлено, что ЭПО значимо изменяет показатели АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (табл. 2). До процедуры гемодиализа скорость агрегации тромбоцитов повышается и достигает значений здоровых людей, ускорение агрегации обусловлено преимущественным увеличением амплитуды, а не укорочением процесса. После гемодиализа скорость агрегации тромбоцитов вновь падает и не отличается от значений в группе больных ХПН, не принимающих ЭПО; по всей видимости, этот факт является дополнительным подтверждением негативной селекции функционально полноценных тромбоцитов в ходе процедуры диализа.

Можно предположить, что ЭПО обладает прямым действием на тромбоциты. Вероятно, на поверхности тромбоцитов экспрессируются рецепторы к ЭПО, опосредующие изменение функциональной активности этих клеток. В пользу данного предположения свидетельствуют результаты недавних исследований у интактных крыс и мышей эффектов ЭПО и его карбамилированного производного (CEPO), не способного связываться с рецепторами ЭПО в гемопоэтической ткани [8]. В частности, было показано, что ЭПО, но не СЕРО увеличивает средний объем тромбоцитов и тромбокрит, повышает аффинитет тромбиновых рецепторов на тромбоцитах, ускоряет коллаген и АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов и повышает количество плазменного Р-селектина. Известно, что в тромбоцитах при уремии нарушена Ca2+-зависимая внутриклеточная сигнализация из-за дефектов в структуре цитоплазматической мембраны и мембран тромбоцитарных гранул, изменяющих поглощение и депонирование этого иона. В свою очередь, кальций играет важную роль в реализации функции тромбоцитов.

Применение ЭПО приводит к восстановлению активности нитроксидергических процессов, оцениваемых по содержанию конечных стабильных метаболитов оксида азота (II) в сыворотке (табл. 3). Общее количество продуктов NO снижается преимущественно за счет нитратов, концентрация нитритов также снижается, но все-таки остается выше, чем в контрольной группе. Процедура гемодиализа не оказывает значимого влияния на выраженность нитроксидергических процессов, т.к. после гемодиализа уровень метаболитов NO не изменяется. Отметим, что наблюдается тенденция к снижению концентрации метаболитов оксида азота (II) после диализа, что может быть связано с удалением этих низкомолекулярных метаболитов в ходе процедуры гемодиализа. Применение ЭПО приводит к изменению уровня активности фактора фон Виллебранда в крови у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (табл. 3). Активность vWF до процедуры гемодиализа снижается, но остается выше, чем в группе здоровых людей. После гемодиализа активность vWF в крови значимо не изменяется.

Восстановление функциональной активности эндотелиоцитов у больных ХПН может иметь принципиальное значение в ограничении окислительного напряжения в организме, цитодеструкции и восстановлении функциональной активности тромбоцитов. Показано, что увеличение скорости агрегации тромбоцитов под влиянием ЭПО нарастает по мере снижения общего количества стабильных метаболитов NO (R=-0,82 р<0,05). Причем значимая связь обнаружена только для нитратов (R=-0,29 р>0,05), но не нитритов (R=-0,89 р<0,05). Полагаем, что ЭПО обладает способностью напрямую вмешиваться в метаболизм эндотелиоцитов. О лиганд-рецепторных взаимодействиях ЭПО и эндотелиоцитов свидетельствует факт наличия на поверхности каждой эндотелиальной клетки порядка 27000 рецепторов для ЭПО. ЭПО оказывает митогенный и хемотактический эффект на эндотелий, что, вероятно, отражает его способность вызывать неоангиогенез, сравнимый с таковым у фактора роста эндотелия. Показано, что внутривенное введение ЭПО в дозе 100-500 ЕД/кг здоровым людям вызывает прямую активацию эндотелия на основании значимого прироста уровня Е-селектина более чем на 100%, а Р-селектина и VCAM-1 - на 50%.

Большинство работ по эндотелиотропным эффектам ЭПО посвящено кардиопротекции. В то же время показано, что протекторное действие ЭПО при экспериментальном синдроме ишемии-реперфузии в миокарде реализуется за счет его эндотелиотропных эффектов, в частности через внутриклеточные сигнальные пути, опосредованные фосфоинтозитид-3-киназой (PI3K) / протеинкиназой В и митоген-активированной протеинкиназой (MEK) ЭПО вмешивается в регуляцию активности NOS и продукцию оксида азота (II). Причем при реперфузионной модели повреждения миокарда синтез NO возрастает, однако ЭПО выступает в роли не стимулятора, а именно регулятора его образования. Указывается, что ЭПО способен подавлять экспрессию eNOS в эндотелиоцитах, уменьшая тем самым продукцию NO, и одновременно стимулирует пролиферативный потенциал эндотелиальных клеток. Однако у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, увеличение продукции NO может быть связано с активацией моноцитов, во время процедуры диализа контактирующих с мембраной диализатора, повышением активности iNOS. В этом отношении интересны сведения о способности ЭПО предупреждать чрезмерную активацию фагоцитов в ходе диализной процедуры [10].

Заключение

Таким образом, при ХПН в условиях дефицита эндогенного ЭПО наблюдаются тромбоцитопения и угнетение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов,  активируются нитроксидергические процессы и повышается уровень фактора фон Виллебранда в сыворотке. Угнетение агрегации тромбоцитов и повышение уровня фактора фон Виллебранда в сыворотке нарастает по мере повышения концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота (II). Применение экзогенного ЭПО у больных ХПН в суммарной дозе около 40000 МЕ увеличивает количество тромбоцитов, тромбокрит, средний объем тромбоцитов, восстанавливает агрегационную способность тромбоцитов, приводит к снижению уровня фактора фон Виллебранда и метаболитов оксида азота (II) в сыворотке. Увеличение скорости агрегации тромбоцитов под влиянием ЭПО нарастает по мере снижения концентрации метаболитов оксида азота (II) в сыворотке.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект 12-04-31726 «Механизм влияния эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов».

Рецензенты:

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России», г. Челябинск.

Абрамовских О.С., д.м.н., старший преподаватель кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России», г. Челябинск.