Изучение симбиозов в настоящее время заняло одно из приоритетных мест в ряду актуальных проблем современной биологии. Микроорганизмы, населяющие репродуктивный тракт женщин, представляют собой пример ассоциативного симбиоза, включающего все компоненты: макросимбионт (человек), доминантный симбионт (лактобациллы) и ассоциативные симбионты (токсоны ассоциативных микроорганизмов) [3]. Исследования в области изучения ассоциативных симбиозов направлены на изучение взаимного влияния макросимбионта и доминантного микросимбионта, а также доминантного и ассоциативных микросимбионтов.

Анализ направленности межмикробных взаимоотношений ассоциативных микросимбионтов позволяет прояснить патогенез широкого спектра заболеваний, правильно оценить происхождение тех или иных аномалий в структуре микросимбионтов, приводящих к изменению их типичных или проявлению новых биологических свойств [1,2].

В связи с этим целью исследования явилось изучение вирулентных свойств урогенитальных энтерококков при взаимодействии с микоплазмами в условиях ассоциативного симбиоза репродуктивного тракта женщин.

В ходе выполнения работы обследовано 168 женщин с воспалительными заболеваниями, среди которых 75 пациенток были больны аднекситом (44,6 %), 53 - кольпитом (31,6 %) и 40 - эндоцервицитом (23,8 %). Группа сравнения составили 75 практически здоровых женщин, репрезентативных по возрасту.

Количественную и качественную оценку состава вагинального микроценоза производили бактериологическим методом в соответствии с Приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.85 [4,5,6]. Для выявления микоплазм использовали прямой вариант МФА с контрастированием фона, культуральный метод и ПЦР. Подбор праймеров и температуры отжига осуществляли при использовании пакета программ «Lasergene» (США).

Используемые праймеры для Enterococcus faecalis: Cylm - 5' ACAGGGAGACTCTCATAGTCGCGG 3'; Сpd - 5' CGCGTGAAGAACAAATGGCCGC 3'; Сps - 5' GGCATCGAAGCTAATGGGTGGGT 3' (табл. 1).

Таблица 1

Использованные в работе праймеры

Ген	Фактор патогенности	Пары праймеров: прямой/обратный	Размер ампликона н.п.
Праймеры энтерококков Enterococcus faecalis
1	Cylm (токси-генность, цитолизин),	5'ACAGGGAGACTCTCATAGTCGCGG 3' 5'CCCCGTGCCGGGGTGCCTGGACCTG 3'	296
2	cpd (бактерии-оциогенность)	5' CGCGTGAAGAACAAATGGCCGC 3' 5'GCTTTCCTGGTAGTTGGCGTAGG 3' '	528
3	cps (адгезия и колонизация)	5' GGCATCGAAGCTAATGGGTGGGT 3' 5' GCTTTCCTGGTAGTTGGCGTAG G 3'	298

В результате исследования установлено, что из всех обследованных женщин энтерококки были выделены из влагалищного и цервикального биотопов у 46,6 % и 26,6 % здоровых и 85,1 % и 55,9 % больных соответственно. У больных женщин энтерококки обнаруживались почти в два раза чаще, чем у здоровых. Плотность микробного обсеменения (ПМО) E. faecalis при воспалительных заболеваниях увеличивалась во влагалище в 2,1 раза, а в цервикальном канале - в 3,4 раза. Штаммы Mycoplasma hominis были выделены у всех 168 женщин.

Изучение вирулентности клинических изолятов Е. faecalis методом внутрибрюшинного заражения мышей показало, что из 237 штаммов энтерококков, выделенных у женщин с заболеваниями репродуктивной системы, только 187 (78,9 %) вызывали гибель животных, показатель LD50 /lg этих штаммов варьировал от 3,6±0,1 до 5,7±0,6. В зависимости от величины показателя штаммы были разделены на три группы. LD50/lg штаммов I группы (39 штаммов) составлял от 3,6±0,1 до 4,4±0,3; II группы - от 4,5±0,4 до 5,0±0,5 (97 штаммов) и III группы - от 5,1±0,7 до 5,7±0,6 (51 штамм).

Для оценки взаимного влияния микросимбионтов на их патогенный потенциал определяли гены, детерминирующие бактериоциногенность (cpd), адгезию (cps), а также токсигенность и цитолитическую активность(cylm) у штаммов E. faecalis (n=142), выделенных из ассоциаций с М. hominis различной степени вирулентности после их совместного культивирования, а также у энтерококков (n=87), выделенных из микробных консорциумов, где микоплазмы не являлись участником микробного сообщества. Исследования показали, что частота встречаемости гена cpd у штаммов E. faecalis, выделенных из ассоциации с микоплазмами, составила 57 %, изолированных без микоплазм - 36,7 %.

Таблица 1

Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей гена cpd сylm, cps у культуры E. fаecalis

Штаммы E. fаecalis, выделенные в ассоциации с микоплазмами:	Совместное культивирование	Частота встречае-мости фрагмента cpd гена (%)	Частота встречае-мости фрагмента ген cps гена (%)	Частота встречае-мости фрагмента cylm гена (%)
авирулентными (n=29)	до сокультивирования	3,4±0,2	4,1±0,6	6,8±0,8
	после 3-х суток сокультивирования	3,8±0,5	4,9±0,8	7,3±0,3
умеренно вирулентными (n=76)	до сокультивирования	14,4±1,7	15,7 ±0,7	35,5±1,3
	после 3-х суток сокультивирования	19,7±2,7*	22,3 ±2,7*	46,7±1,7*
высоко вирулентными (n=37)	до сокультивирования	54,1±2,9	67,5±3,5	48,6±7,2
	после 3-х суток сокультивирования	86,5±3,5*	92,5±4,5*	78,3±6,4 *
Выделенные в виде монокультур	до сокультивирования	3,2±0,5	3,6±0,1	2,2±0,1
	после 3-х суток сокультивирования	3,7±0,7	3,9±0,7	3,1±0,2

Примечание: * - показатель достоверности различия между уровнем частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей гена cpd у культур E. fаecalis до и после их сокультивирования с М. hominis (р<0,05).

Тестирование E. faecalis после сокультивирования с авирулентными, с умеренновирулентными и высоковирулентными микоплазмами в течение трех суток выявило достоверное (р<0,05) повышение частоты встречаемости искомых ампликонов у вирулентных штаммов (табл.1). В дальнейшие сроки исследования частота встречаемости изучаемых ампликонов не изменялась (р>0,05).

В группе энтероккоков, выделенных без микоплазм, частота встречаемости генетических детерминант сylm, cpd, cps после совместного культивирования с микоплазмами достоверно не изменялась.

Таким образом, установлено, что после сокультивирования энтерококков с микоплазмами различной вирулентности возрастает частота встречаемости всех пар праймеров сylm (токсигенность, цитолизин), cpd (бактерииоциогенность), cps (адгезия и колонизация) по сравнению с показателями, полученными до сокультивирования, что приводило к формированию более выраженной патогенности штаммов энтерококков.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (№14.B37.21.2010)

Рецензенты:

Ильина Н. А., д.б.н., профессор кафедры зоологии, проректор по научной работе ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова», г. Ульяновск.

Нестеров А. С., д.м.н., профессор кафедры инфекционных и кожно-венерических болезней ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», г. Ульяновск.