Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,006

FISH OIL AUTOXIDATION OXICHEMILUMINESCENCE

Вепринцев Т.Л., Наумов В.В.
The chemiluminescence of fish oil solutions in chlorobenzene has been investigated in the temperature range from 30 to 70ºC. Specific light intensity ranged from 56400 to 786000 quants/(g•s). The radiation was multifoldly enhanced by chemiluminescence activators – 9,10-dibromoanthracene and Eu3+-1,10-phenanthroline-tris(thenoyltrifluoroacetonate).

В основе множества патологических состояний лежит разрушение липидных структур клеток вследствие свободнорадикального окисления, инициированного активными формами кислорода [7, 8, 13]. Качество пищевых, фармацевтических и технических продуктов, содержащих липиды, также во многом зависит от интенсивности и глубины процессов перекисного (свободнорадикального) окисления липидов [11, 12, 16]. Поэтому разработка экспресс-метода контроля за интенсивностью этих процессов представляется весьма актуальной. Особое внимание привлекает удобный и чувствительный хемилюминесцентный метод, используемый в химии для регистрации кинетики окисления углеводородов и тестирования антиоксидантов [6, 10, 14, 18, 22]. Однако по хемилюминесценции липидов и их аналогов литературные данные отрывочны и носят лишь качественный характер.

Целью настоящей работы является количественное исследование кинетики оксихемилюминесценции липидов и выявление ее механизмов.

p

Рис.1. Установка для изучения оксихемилюминесценции в жидкой фазе

МЕТОДИКА И МАТЕРИАЛЫ

Объектом исследования выбран рыбий жир (ТУ Р 71.566.48, Тверская фармацевтическая фабрика), легко окисляющийся вследствие высокой ненасыщенности его липидов и содержащий умеренное количество антиоксидантов [16]. В качестве растворителя использовали хлорбензол (Acros Organics, 99+%). Регистрацию свечения осуществляли при помощи фотоэлектрического умножителя (ФЭУ) в составе модуля Н7467 фирмы Hamamatsu (Япония), работающего в режиме счета фотонов.

Окисление проводили при температуре 30 ¸ 70°С и непрерывном барботировании воздуха на установке, представленной на рис. 1: термостатируемая ячейка-реактор (1), снабженная устройствами для барботажа (2), ввода добавок (3) и обратным холодильником (4) была размещена в светонепроницаемой камере (5) со встроенным модулем Н7467 (6), подключенным к компьютеру (7). Светосбор осуществлялся при помощи параболического зеркала (8) и стеклянного цилиндрического световода (9). Процент светосбора составлял 1.92%, т.е. в фотоумножитель попадало 1.92% полного излучения образца.

В ряде опытов использовали активаторы хемилюминесценции - 9,10-дибромантрацен и Eu3+-1,10-фенантролин-трис(теноил-трифторацетонат) (хелат европия) [2].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На рисунках 2-3 приведена кинетика хемилюминесценции растворов рыбьего жира в хлорбензоле при различных температурах и концентрациях. Можно видеть, что все кривые сходны по форме - интенсивность хемилюминесценции снижается по мере увеличения времени инкубации и приближается к определенному квазистационарному уровню, зависящему от исходной концентрации рыбьего жира и температуры опыта. Кривые, полученные при более высоких концентрациях при одной и той же температуре, расположены выше кривых, соответствующих меньшим концентрациям (рис. 3). Увеличение концентрации рыбьего жира приводит к пропорциональному возрастанию интенсивности хемилюминесценции (рис. 3). Это указывает на однотипный характер кинетики в исследованном диапазоне концентраций.

p

p

Рис. 2. Кинетические кривые хемилюминесценции при окислении раствора (112.5 г/л) рыбьего жира в хлорбензоле. 1 - шум ФЭУ, 2 - хлорбензол

 

Рис. 3. Кинетические кривые хемилюминесценции растворов рыбьего жира в хлорбензоле при температуре 60ºС. 1 - шум ФЭУ. Концентрации: 2 - 0; 3 - 112.5; 4 - 225.0; 5 - 337.5 г/л

Анализ литературных данных показывает, что в углеводородных системах возможны 2 механизма оксихемилюминесценции:

1) свободнорадикальный, когда при взаимодействии пероксидных радикалов (ROO·) образуется продукт в возбужденном электронном состоянии (*), быстро переходящий в основное состояние с испусканием кванта света [1, 5, 9, 18, 20, 22]

ROO· + ROO· → ROH + R1=O* → R1=O + ,

2) молекулярный, когда квант света излучается при распаде промежуточного продукта окисления - диоксетана (D) [3, 4, 17, 19],

Реагенты → D → R1=O + R2=O* → R2=O + .

В первом случае интенсивность свечения, пропорциональная квадрату концентрации свободных пероксидных радикалов, должна снижаться при введении в систему антиоксидантов, реагирующих с этими радикалами и снижающих их концентрацию.

Известно, что липиды природного происхождения обычно содержат природные антиоксиданты, являющиеся ловушками свободных радикалов [7, 8, 16]. Следовательно, в их присутствии концентрации свободных радикалов незначительны. Поэтому можно отдать предпочтение второму механизму хемилюминесценции. Для доказательства этого на разных стадиях инкубации в исследуемый раствор добавляли высокоэффективный антиоксидант токоферол в концентрациях (2.5 ÷ 36)·10-5 моль/л, способных полностью подавлять свободнорадикальную хемилюминесценцию, возбуждаемую по первому механизму [7, 15, 20]. При этом интенсивность свечения оставалась без изменений, что подтверждает предположение о молекулярном механизме хемилюминесценции.

Учитывая, что квантовый выход фотоумножителя составляет 10%, была вычислена удельная интенсивность хемилюминесценции рыбьего жира (количество фотонов, излучаемое в единицу времени единицей массы жира) в исследованном температурном диапазоне (таблица 1).

Таблица 1. Удельная интенсивность хемилюминесценции раствора рыбьего жира в хлорбензоле

Температура, °С

Удельная интенсивность x 10-3, фотон/(г·с),

среднее значение ± стандартное отклонение

максимальная

(начало опыта)

минимальная

(после 20 мин. инкубации)

30

91.4 ± 0.006

56,4 ± 0.050

40

112 ± 11.4

59.3 ± 6.03

50

204 ± 22.9

98.4 ± 2.78

60

518 ± 9.21

219 ± 11.6

70

786 ± 14.0

223 ± 11.8

Излучение фотона происходит при переходе молекулы продукта окисления из электронно-возбуждённого состояния (Р*) в основное (Р) по реакции

Р* → Р + фотон.

При этом дожно выполняться соотношение

ΔЕ* = Е* - Еоhν,


где Ео и Е* - энергии основного и возбужденного состояний, hν - энергия фотона.

Оценка энергии возбужденных состояний возможна благодаря использованию активаторов хемилюминесценции (А) - химически инертных веществ, способных участвовать в переносе электронной энергии по реакции

Р* + А → Р + А*

с последующим излучением фотона [1, 2, 4, 22]

А* → А + фотон.

Нами были использованы два активатора - 9, 10-дибромантрацен (ДБА) и хелат европия (ХЕ), энергии возбужденных состояний которых (ΔЕ*) равны 297 и 243 кДж/моль соответственно[1, 2, 4]. Концентрацию хелата европия варьировали в диапазоне от 9.76·10-5 до 36.4·10-5 моль/л, что соответствовало усилению хемилюминесценции в 7 ÷ 23 раза. Диапазон концентраций ДБА составлял 2.27 ¸ 25 ммоль/л. Это соответствовало усилению хемилюминесценции в 1.27 ÷ 4.4 раза. Эффективный перенос энергии с электронно-возбужденных молекул продуктов окисления (Р*) на молекулы активаторов говорит о том, что энергетические уровни возбужденных состояний продуктов окисления липидов рыбьего жира расположены выше уровней активаторов, т.е.

ΔЕ*Р ≥ ΔЕ*ДБА = 297кДж/моль > ΔЕ*ХЕ = 243кДж/моль.

Возможность многократного усиления хемилюминесценции активаторами показывает, что их квантовый выход люминесценции и время жизни возбужденных состояний много больше, чем у продуктов окисления Р*, имеющих предположительно кетонную природу [1].

Значения интенсивности хемилюминесценции, полученные при одной и той же глубине (по времени) процесса инкубации, но при разных температурах, были использованы для построения графиков температурных зависимостей в координатах ln It ¸ 1/T, где It - интенсивность хемилюминесценции в момент времени t, T - абсолютная температура. Таким образом были получены температурные зависимости хемилюминесценции, соответствующие моментам времени инкубации 60, 120, 180, 300, 480, 780 и 1200с. Коэффициенты корреляции превышали 0.97 и являлись значимыми для уровня Р = 0.0001 согласно t-критерию Стьюдента. Линейные коэффициенты наклона полученных прямых были использованы для вычисления энергии активации, значение которой (± стандартное отклонение) составило 43.8 ± 2.5 кДж/моль. Эта величина близка к значению 41.9 кДж/моль полученному для линоленовой кислоты в работе [21].

По результатам работы можно заключить, что источником хемилюминесценции липидов, содержащих антиоксиданты, являются промежуточные продукты окисления молекулярной природы. Полученные количественные характеристики могут быть использованы для разработки методов мониторинга перекисного окисления липидов и детализации механизмов оксихемилюминесценции, что будет являться предметом дальнейших исследований.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

  • 1.   Беляков В.А., Васильев Р.Ф. // В сб. Молекулярная фотоника. Л.: Наука. Ленингр. отд. 1970. С. 70
  • 2.   Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. // Изв. АН СССР. Сер. физ. 1973. Т.37. №4. С. 747.
  • 3.   Беляков В.А., Филиппова Т.В., Заседателев С.Ю., Блюмберг Э.А. Хемилюминесценция при окислении непредельных углеводородов // Изв. АН СССР. Сер. хим. 1979. С. 1485-1489.
  • 4.   Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. // Изв. АН СССР. Сер. хим. 1983. №12. С. 2709-2717.
  • 5.   Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Иванова Н.М., Минаев Б.Ф., Осяева О.В., Федорова Г.Ф. // Изв. АН СССР. Сер. физ. 1987. Т. 51. №3. С. 2709.
  • 6.   Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. // Кинетика и катализ. 2004. Т. 45. № 3. С. 355.
  • 7.   Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. // Успехи химии. 1985. Т. 54. С. 1540.
  • 8.   Бурлакова Е.Б. //Рос. хим. ж. 2007. Т.51. № 1. С. 3.
  • 9.   Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. //Кинетика и катализ. 2004. Т. 45. С. 695.
  • 10. Васильев Р.Ф., Наумов В.В., Трофимов А.В., Федорова Г.Ф. //Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения. (Под ред. Е.Б. Бурлаковой) М.: Изд-во РУДН. 2005. С. 39.
  • 11. Заиков Г.Е. // СОЖ, 2000, №12, с. 48-55.
  • 12. Заиков Г.Е. // СОЖ, 2001, №9, с. 50-56.
  • 13. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. - М. : МАИК "Наука / Интерпериодика", 2001. 343 С.
  • 14. Наумов В.В., Храпова Н.Г. // Кинетика и катализ. 1984. Т. 25. № 3. С. 563.
  • 15. Наумов В.В., Васильев Р.Ф. // Кинетика и катализ. 2003. Т. 44. № 1. С. 111.
  • 16. Ржавская Ф.М. Жиры рыб и морских млекопитающих. М.: Пищевая промышленность. 1976. 471 С.
  • 17. Шарипов Г.Л., Казаков В.П., Толстиков Г.А. Химия и хемилюминесценция 1.2‑диоксетанов. М.: Наука. 1990. 288 С.
  • 18. Шляпинтох В.Я., Карпухин О.Н., Постников Л.М. Захаров И.П., Вичутинский А.А., Цепалов В.Ф. Хемилюминесцентные методы исследования медленных химических процессов. М.: Наука. 1966. 300 С.
  • 19. Adam W., Trofimov A.V.// The Chemistry of Peroxides, Ed. by Z. Rappoport. Chichester, UK: John Wiley & Sons. 2006. V.2. P. 1171.
  • 20. Denisov E.T., Afanas'ev I.B. Oxidation and Antioxidants in Organic Chemistry and Biology. CRC: Har/Cdr edition. 2005. 1024 P.
  • 21. Slawson V., Adamson A.W. // Lipids. 1976. V. 11. N. 6. P. 472.
  • 22. Vassil'ev R.F. // Progress in reaction kinetics. V. 4. Ed. by G. Porter. Oxford-London-Edinburge-NY: Pregamon Press. 1967. P. 305.