Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

FISH OIL AUTOXIDATION OXICHEMILUMINESCENCE

Вепринцев Т.Л., Наумов В.В.
Проведено исследование оксихемилюминесценции растворов рыбьего жира в хлорбензоле в температурном диапазоне от 30 до 70 ºС. Удельная интенсивность свечения изменялась от 56400 до 786000 фотонов/(г•с). Излучение многократно усиливали активаторы хемилюминесценции – 9,10-дибромантрацен и Eu3+-1,10-фенантролин-трис(теноил-трифтор-ацетонат).
The chemiluminescence of fish oil solutions in chlorobenzene has been investigated in the temperature range from 30 to 70ºC. Specific light intensity ranged from 56400 to 786000 quants/(g•s). The radiation was multifoldly enhanced by chemiluminescence activators – 9,10-dibromoanthracene and Eu3+-1,10-phenanthroline-tris(thenoyltrifluoroacetonate).

В основе множества патологических состояний лежит разрушение липидных структур клеток вследствие свободнорадикального окисления, инициированного активными формами кислорода [7, 8, 13]. Качество пищевых, фармацевтических и технических продуктов, содержащих липиды, также во многом зависит от интенсивности и глубины процессов перекисного (свободнорадикального) окисления липидов [11, 12, 16]. Поэтому разработка экспресс-метода контроля за интенсивностью этих процессов представляется весьма актуальной. Особое внимание привлекает удобный и чувствительный хемилюминесцентный метод, используемый в химии для регистрации кинетики окисления углеводородов и тестирования антиоксидантов [6, 10, 14, 18, 22]. Однако по хемилюминесценции липидов и их аналогов литературные данные отрывочны и носят лишь качественный характер.

Целью настоящей работы является количественное исследование кинетики оксихемилюминесценции липидов и выявление ее механизмов.

p

Рис.1. Установка для изучения оксихемилюминесценции в жидкой фазе

МЕТОДИКА И МАТЕРИАЛЫ

Объектом исследования выбран рыбий жир (ТУ Р 71.566.48, Тверская фармацевтическая фабрика), легко окисляющийся вследствие высокой ненасыщенности его липидов и содержащий умеренное количество антиоксидантов [16]. В качестве растворителя использовали хлорбензол (Acros Organics, 99+%). Регистрацию свечения осуществляли при помощи фотоэлектрического умножителя (ФЭУ) в составе модуля Н7467 фирмы Hamamatsu (Япония), работающего в режиме счета фотонов.

Окисление проводили при температуре 30 ¸ 70°С и непрерывном барботировании воздуха на установке, представленной на рис. 1: термостатируемая ячейка-реактор (1), снабженная устройствами для барботажа (2), ввода добавок (3) и обратным холодильником (4) была размещена в светонепроницаемой камере (5) со встроенным модулем Н7467 (6), подключенным к компьютеру (7). Светосбор осуществлялся при помощи параболического зеркала (8) и стеклянного цилиндрического световода (9). Процент светосбора составлял 1.92%, т.е. в фотоумножитель попадало 1.92% полного излучения образца.

В ряде опытов использовали активаторы хемилюминесценции - 9,10-дибромантрацен и Eu3+-1,10-фенантролин-трис(теноил-трифторацетонат) (хелат европия) [2].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На рисунках 2-3 приведена кинетика хемилюминесценции растворов рыбьего жира в хлорбензоле при различных температурах и концентрациях. Можно видеть, что все кривые сходны по форме - интенсивность хемилюминесценции снижается по мере увеличения времени инкубации и приближается к определенному квазистационарному уровню, зависящему от исходной концентрации рыбьего жира и температуры опыта. Кривые, полученные при более высоких концентрациях при одной и той же температуре, расположены выше кривых, соответствующих меньшим концентрациям (рис. 3). Увеличение концентрации рыбьего жира приводит к пропорциональному возрастанию интенсивности хемилюминесценции (рис. 3). Это указывает на однотипный характер кинетики в исследованном диапазоне концентраций.

p

p

Рис. 2. Кинетические кривые хемилюминесценции при окислении раствора (112.5 г/л) рыбьего жира в хлорбензоле. 1 - шум ФЭУ, 2 - хлорбензол

 

Рис. 3. Кинетические кривые хемилюминесценции растворов рыбьего жира в хлорбензоле при температуре 60ºС. 1 - шум ФЭУ. Концентрации: 2 - 0; 3 - 112.5; 4 - 225.0; 5 - 337.5 г/л

Анализ литературных данных показывает, что в углеводородных системах возможны 2 механизма оксихемилюминесценции:

1) свободнорадикальный, когда при взаимодействии пероксидных радикалов (ROO·) образуется продукт в возбужденном электронном состоянии (*), быстро переходящий в основное состояние с испусканием кванта света [1, 5, 9, 18, 20, 22]

ROO· + ROO· → ROH + R1=O* → R1=O + ,

2) молекулярный, когда квант света излучается при распаде промежуточного продукта окисления - диоксетана (D) [3, 4, 17, 19],

Реагенты → D → R1=O + R2=O* → R2=O + .

В первом случае интенсивность свечения, пропорциональная квадрату концентрации свободных пероксидных радикалов, должна снижаться при введении в систему антиоксидантов, реагирующих с этими радикалами и снижающих их концентрацию.

Известно, что липиды природного происхождения обычно содержат природные антиоксиданты, являющиеся ловушками свободных радикалов [7, 8, 16]. Следовательно, в их присутствии концентрации свободных радикалов незначительны. Поэтому можно отдать предпочтение второму механизму хемилюминесценции. Для доказательства этого на разных стадиях инкубации в исследуемый раствор добавляли высокоэффективный антиоксидант токоферол в концентрациях (2.5 ÷ 36)·10-5 моль/л, способных полностью подавлять свободнорадикальную хемилюминесценцию, возбуждаемую по первому механизму [7, 15, 20]. При этом интенсивность свечения оставалась без изменений, что подтверждает предположение о молекулярном механизме хемилюминесценции.

Учитывая, что квантовый выход фотоумножителя составляет 10%, была вычислена удельная интенсивность хемилюминесценции рыбьего жира (количество фотонов, излучаемое в единицу времени единицей массы жира) в исследованном температурном диапазоне (таблица 1).

Таблица 1. Удельная интенсивность хемилюминесценции раствора рыбьего жира в хлорбензоле

Температура, °С

Удельная интенсивность x 10-3, фотон/(г·с),

среднее значение ± стандартное отклонение

максимальная

(начало опыта)

минимальная

(после 20 мин. инкубации)

30

91.4 ± 0.006

56,4 ± 0.050

40

112 ± 11.4

59.3 ± 6.03

50

204 ± 22.9

98.4 ± 2.78

60

518 ± 9.21

219 ± 11.6

70

786 ± 14.0

223 ± 11.8

Излучение фотона происходит при переходе молекулы продукта окисления из электронно-возбуждённого состояния (Р*) в основное (Р) по реакции

Р* → Р + фотон.

При этом дожно выполняться соотношение

ΔЕ* = Е* - Еоhν,


где Ео и Е* - энергии основного и возбужденного состояний, hν - энергия фотона.

Оценка энергии возбужденных состояний возможна благодаря использованию активаторов хемилюминесценции (А) - химически инертных веществ, способных участвовать в переносе электронной энергии по реакции

Р* + А → Р + А*

с последующим излучением фотона [1, 2, 4, 22]

А* → А + фотон.

Нами были использованы два активатора - 9, 10-дибромантрацен (ДБА) и хелат европия (ХЕ), энергии возбужденных состояний которых (ΔЕ*) равны 297 и 243 кДж/моль соответственно[1, 2, 4]. Концентрацию хелата европия варьировали в диапазоне от 9.76·10-5 до 36.4·10-5 моль/л, что соответствовало усилению хемилюминесценции в 7 ÷ 23 раза. Диапазон концентраций ДБА составлял 2.27 ¸ 25 ммоль/л. Это соответствовало усилению хемилюминесценции в 1.27 ÷ 4.4 раза. Эффективный перенос энергии с электронно-возбужденных молекул продуктов окисления (Р*) на молекулы активаторов говорит о том, что энергетические уровни возбужденных состояний продуктов окисления липидов рыбьего жира расположены выше уровней активаторов, т.е.

ΔЕ*Р ≥ ΔЕ*ДБА = 297кДж/моль > ΔЕ*ХЕ = 243кДж/моль.

Возможность многократного усиления хемилюминесценции активаторами показывает, что их квантовый выход люминесценции и время жизни возбужденных состояний много больше, чем у продуктов окисления Р*, имеющих предположительно кетонную природу [1].

Значения интенсивности хемилюминесценции, полученные при одной и той же глубине (по времени) процесса инкубации, но при разных температурах, были использованы для построения графиков температурных зависимостей в координатах ln It ¸ 1/T, где It - интенсивность хемилюминесценции в момент времени t, T - абсолютная температура. Таким образом были получены температурные зависимости хемилюминесценции, соответствующие моментам времени инкубации 60, 120, 180, 300, 480, 780 и 1200с. Коэффициенты корреляции превышали 0.97 и являлись значимыми для уровня Р = 0.0001 согласно t-критерию Стьюдента. Линейные коэффициенты наклона полученных прямых были использованы для вычисления энергии активации, значение которой (± стандартное отклонение) составило 43.8 ± 2.5 кДж/моль. Эта величина близка к значению 41.9 кДж/моль полученному для линоленовой кислоты в работе [21].

По результатам работы можно заключить, что источником хемилюминесценции липидов, содержащих антиоксиданты, являются промежуточные продукты окисления молекулярной природы. Полученные количественные характеристики могут быть использованы для разработки методов мониторинга перекисного окисления липидов и детализации механизмов оксихемилюминесценции, что будет являться предметом дальнейших исследований.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

  • 1.   Беляков В.А., Васильев Р.Ф. // В сб. Молекулярная фотоника. Л.: Наука. Ленингр. отд. 1970. С. 70
  • 2.   Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. // Изв. АН СССР. Сер. физ. 1973. Т.37. №4. С. 747.
  • 3.   Беляков В.А., Филиппова Т.В., Заседателев С.Ю., Блюмберг Э.А. Хемилюминесценция при окислении непредельных углеводородов // Изв. АН СССР. Сер. хим. 1979. С. 1485-1489.
  • 4.   Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. // Изв. АН СССР. Сер. хим. 1983. №12. С. 2709-2717.
  • 5.   Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Иванова Н.М., Минаев Б.Ф., Осяева О.В., Федорова Г.Ф. // Изв. АН СССР. Сер. физ. 1987. Т. 51. №3. С. 2709.
  • 6.   Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. // Кинетика и катализ. 2004. Т. 45. № 3. С. 355.
  • 7.   Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. // Успехи химии. 1985. Т. 54. С. 1540.
  • 8.   Бурлакова Е.Б. //Рос. хим. ж. 2007. Т.51. № 1. С. 3.
  • 9.   Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. //Кинетика и катализ. 2004. Т. 45. С. 695.
  • 10. Васильев Р.Ф., Наумов В.В., Трофимов А.В., Федорова Г.Ф. //Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения. (Под ред. Е.Б. Бурлаковой) М.: Изд-во РУДН. 2005. С. 39.
  • 11. Заиков Г.Е. // СОЖ, 2000, №12, с. 48-55.
  • 12. Заиков Г.Е. // СОЖ, 2001, №9, с. 50-56.
  • 13. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. - М. : МАИК "Наука / Интерпериодика", 2001. 343 С.
  • 14. Наумов В.В., Храпова Н.Г. // Кинетика и катализ. 1984. Т. 25. № 3. С. 563.
  • 15. Наумов В.В., Васильев Р.Ф. // Кинетика и катализ. 2003. Т. 44. № 1. С. 111.
  • 16. Ржавская Ф.М. Жиры рыб и морских млекопитающих. М.: Пищевая промышленность. 1976. 471 С.
  • 17. Шарипов Г.Л., Казаков В.П., Толстиков Г.А. Химия и хемилюминесценция 1.2‑диоксетанов. М.: Наука. 1990. 288 С.
  • 18. Шляпинтох В.Я., Карпухин О.Н., Постников Л.М. Захаров И.П., Вичутинский А.А., Цепалов В.Ф. Хемилюминесцентные методы исследования медленных химических процессов. М.: Наука. 1966. 300 С.
  • 19. Adam W., Trofimov A.V.// The Chemistry of Peroxides, Ed. by Z. Rappoport. Chichester, UK: John Wiley & Sons. 2006. V.2. P. 1171.
  • 20. Denisov E.T., Afanas'ev I.B. Oxidation and Antioxidants in Organic Chemistry and Biology. CRC: Har/Cdr edition. 2005. 1024 P.
  • 21. Slawson V., Adamson A.W. // Lipids. 1976. V. 11. N. 6. P. 472.
  • 22. Vassil'ev R.F. // Progress in reaction kinetics. V. 4. Ed. by G. Porter. Oxford-London-Edinburge-NY: Pregamon Press. 1967. P. 305.