Введение
Использование современной интенсивной радио- и химиотерапии в лечении онкологических заболеваний требует применения препаратов сопровождения для улучшения их переносимости, профилактики развития побочных эффектов, в том числе угнетения костномозгового кроветворения [1-4]. Токсическое воздействие противоопухолевой терапии на костный мозг, вызывающее подавлению его кроветворной функции, является одним из наиболее значимых; уменьшение числа нейтрофильных лейкоцитов нередко ведет к развитию тяжелых инфекций, что может оказаться критическим в плане невозможности продолжения лечения [2,3]. Перспективными миелопротекторами являются лекарственные средства, созданные на основе эндогенных регуляторов гемопоэза. Использование отечественного препарата лейкостима в терапии ряда онкологических новообразований является экономически более выгодным в связи с меньшей себестоимостью лечения, по сравнению с импортными аналогами [1].
Цель исследования: изучить миелопротекторную эффективность лейкостима при экспериментальной лучевой супрессии гемопоэза.
Материалы и методы исследования
Исследование проведено в лаборатории кафедры общей и клинической фармакологии Медицинского института Пензенского государственного университета. Эксперименты были выполнены на 30 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла массой 2,5-3,0 кг. Животных содержали на стандартном пищевом рационе вивария со свободным доступом к воде. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (ETSN 123, Страсбург, 18 марта 1986 г.) и были одобрены локальным этическим комитетом.
С учетом цели исследования было сформировано 3 группы животных. Группа №1 (n=10) являлась интактной. Животные групп №2 (n=10), №3 (n=10) подвергались однократному воздействию ионизирующей радиации. Для моделирования лучевого повреждения проводилось облучение с помощью аппарата АГАТ-«С» разовой очаговой дозой 5 Гр, расстояние от источника ионизации до ионизируемой поверхности составляло 90 см, процентная доза равнялась 94 %, а максимальная доза облучения составила 5,31 Гр. Животным группы № 3 вводили препарат филграстим (лейкостим, ЗАО "Биокад", Россия) в дозе 16 мкг/кг однократно подкожно через 1 ч после облучения. Для исследования костного мозга проводили пункцию подвздошной кости под местным обезболиванием раствором новокаина 2 % - 2,0 мл при помощи асептической аспирации иглой Кассирского и шприцом (обезвоженными) до начала эксперимента, на 3, 7, 10, 14, 21, 28 сутки. Из части полученного пунктата готовили мазки, другую - разводили для подсчета миелокариоцитов и мегакариоцитов. Производили цитологический анализ мазков пунктата. Статистическую обработку результатов экспериментального исследования проводили с помощью пакета статистических программ: русифицированная версия программы STATISTICA 6.0 (StatSoft - Russia, 1999), BIOSTAT (S. A.Glantz, McGrawHill, перевод на русский язык - «Практика, 1998). Определялись основные статистические характеристики: среднее, стандартное квадратическое отклонение. Достоверность различий рассчитана с помощью Т-критерия Стьюдента в случае равенства дисперсий, его модификации (Т-критерий с раздельными оценками дисперсий) в случае неравенства дисперсий и с поправкой Бонферрони для множественных сравнений.
Результаты исследования и их обсуждение
В костном мозге животных на фоне лейкостима абсолютное количество миелокариоцитов возросло с 16,01±2,96х109/л до 27,50±5,24х109/л и оставалось выше такового в группе интактных животных в течение 3-х недель наблюдения, а на 28-е сутки не отличалось от значения показателя в группе интактных животных (табл. 1). Классической пострадиационной динамики с опустошением кроветворной ткани после лучевого повреждения, транзиторным подъемом за счет задействования сохранных очагов кроветворения, не наблюдалось.
Таблица 1
Пострадиационная динамика абсолютного количества клеток костного мозга кроликов на фоне лейкостима, М (s)
|
Сутки Показатель |
3-е сутки |
5-е сутки |
7-е сутки |
10-е сутки |
14-е сутки |
21-е сутки |
28-е сутки |
|
Миелокариоциты х109/л |
16,00 (3,41) |
19,50 (3,41) |
11,50 (4,83) |
10,20 (2,34) |
12,40 (2,80) |
11,50 (2,19) |
19,20 (2,76) |
|
1,70 (0,29)* |
2,50 (0,34)* |
2,00 (0,44)* |
3,00 (0,43)* |
4,50 (0,63)* |
84,00 (12,63) |
26,00 (5,20)* |
|
|
27,50 (5,24)*# |
22,50 (4,85)*# |
17,50 (3,96) *# |
17,60 (3,98)*# |
18,00 (3,92)*# |
18,50 (3,74)*# |
19,00 (4,05)# |
|
|
Мегакариоциты х103/л |
133,77 (22,03) |
200,00 (34,63) |
120,00 (16,12) |
102,00 (22,45) |
150,00 (23,50) |
115,00 (14,21) |
174,00 (20,46) |
|
32,10 (5,88)* |
25,00 (4,98)* |
27,78 (4,80)* |
35,00 (4,68)* |
45,89 (6,18)* |
842,36 (103,59)* |
495,67 (64,90)* |
|
|
69,31 (12,18)*# |
68,75 (12,10)*# |
75,00 (14,16)*# |
62,55 (13,90)*# |
50,00 (9,70)* |
75,0 (16,95)*# |
81,25 (16,35) * # |
|
|
Митоз х109/л |
0,112 (0,021) |
0,098 (0,022) |
0,115 (0,027) |
0,112 (0,022) |
0,112 (0,019) |
0,115 (0,011) |
0,154 (0,013) |
|
0,017 (0,011) * |
0,025 (0,011) * |
0,044 (0,009)* |
0,060 (0,078)* |
0,090 (0,01) |
1,978 (0,443)* |
0,390 (0,066)* |
|
|
0,302 (0,068)*# |
0,180 (0,032) *# |
0,175 (0,035) *# |
0,210 (0,045)*# |
0,252 (0,042)*# |
0,296 (0,062)*# |
0,342 (0,059)*# |
|
|
Бластные клетки х109/л |
0,595 (0,021) |
0,623 (0,018) |
0,432 (0,013) |
0,558 (0,075) |
0,481 (0,040) |
0,581 (0,067) |
0,612 (0,080) |
|
0,120 (0,016)* |
0,180 (0,015) * |
0,150 (0,024)* |
0,250 (0,067)* |
0,385 (0,058) |
6,640 (1,500)* |
0,720 (0,111) |
|
|
0,988 (0,201)*# |
0,774 (0,126)*# |
0,722 (0,130)*# |
0,763 (0,110)*# |
0,762 (0,190)*# |
0,756 (0,150)*# |
0,712 (0,142)*# |
|
|
1,299 (0,163)*# |
1,345 (0,203)*# |
0,969 (0,127)*# |
0,775 (0,112)*# |
1,033 (0,202)*# |
1,065 (0,220)*# |
1,068 (0,205)# |
|
|
Палочкоядерные нейтрофилы х109/л |
0,999 (0,120) |
1,560 (0,074) |
0,920 (0,112) |
0,714 (0,165) |
0,868 (0,128) |
0,920 (0,114) |
1,536 (0,186) |
|
0,090 (0,012)* |
0,130 (0,034) * |
0,109 (0,018)* |
0,194 (0,028)* |
0,231 (0,041)* |
4,501 (0,720)* |
0,753 (0,089)* |
|
|
2,212 (0,386)*# |
2,219 (0,356)*# |
1,647 (0,290)*# |
1,319 (0,278)*# |
1,758 (0,327)*# |
1,818 (1,340)*# |
1,880 (0,408)*# |
|
|
Сегментоядерные нейтрофилы х109/л |
1,419 (0,250) |
2,535 (0,220) |
1,380 (0,220) |
1,428 (0,209) |
1,488 (0,210) |
1,495 (0,214) |
2,304 (0,224) |
|
0,190 (0,023)* |
0,150 (0,034) |
0,043 (0,006)* |
0,094 (0,012)* |
0,134 (0,024)* |
2,380 (0,41)* |
3,095 (0,540)* |
|
|
3,141 (0,609)*# |
3,251 (0,695)*# |
2,341 (0,417)# |
1,873 (0,313)# |
2,497 (1,380)*# |
2,583 (0,375)*# |
2,520 (0,590)# |
|
|
Лимфоциты х109/л |
3,746 (0,790) |
4,290 (0,760) |
2,415 (0,615) |
2,346 (0,614) |
2,976 (0,679) |
2,530 (0,860) |
4,224 (0,750) |
|
0,470 (0,085)* |
0,740 (0,078)* |
0,537 (0,072)* |
0,569 (0,102)* |
1,220 (0,104)* |
29,815 (3,070)* |
9,553 (1,659)* |
|
|
8,728 (1,513)*# |
4,899 (0,815)# |
3,409 (0,738)*# |
5,244 (0,941) *# |
4,196 (0,098)*# |
3,621 (0,767)*# |
4,083 (0,782)# |
Примечание:
обычный шрифт - группа интактных животных;
жирный шрифт - опытная группа (облучение с введением лейкостима);
различия статистически значимы относительно: * - р1<0,05 - интактной группы;
# - р2<0,05 - группы с облучением без лекарственной коррекции.
Численность мегакариоцитов на фоне лейкостимана на протяжении периода исследования статистически значимо сократилась в среднем в 2-3 раза, однако удерживалась статистически выше контрольных цифр в первые 10 дней опыта (р1<0,05, р2<0,05), восстановления мегакариоцитарного ростка не наблюдалось. В контрольной группе двухнедельный дефицит мегакариоцитов был более глубоким, затем следовало резкое увеличение абсолютного количества мегакариоцитов.
Пострадиационного снижения митотической активности миелокариоцитов на фоне лейкостима не наблюдалось в течение всего эксперимента. Абсолютное количество митотически делящихся предшественников на протяжении всего опыта статистически значимо превышало значение показателя у интактных животных: 3-и сутки опыта - в 2,7 раза, в дальнейшем до конца эксперимента находилось в пределах от 0,175±0,035х109/л до 0,342±0,059х109/л. (р1<0,05). В контрольной группе животных после лучевого повреждения отмечалось длительное и глубокое торможение митотической активности миелокариоцитов с абортивным подъемом показателя на 21-е сутки эксперимента.
Абсолютное содержание бластных клеток на фоне лейкостима также на протяжении всего периода исследования статистически значимо превышало значение показателя в группе интактных животных (р1<0,05) с максимальным подъемом в 1,7 раза на 3-и сутки опыта. В группе контроля отмечался продолжительный период послелучевого дефицита бластных клеток в сочетании с резким повышением их количества на 21-е сутки эксперимента.
Абсолютное количество костномозговых палочкоядерных нейтрофилов на фоне лейкостима статистически значимо превышало значения показателя в группе интактных животных на протяжении всего эксперимента в 1,4-2,2 раза, сегментоядерных нейтрофилов - в 1,3 - 1,7 раза. В группе контроля отмечался глубокий и продолжительный (до 3-х недель) период послелучевого дефицита зрелых гранулоцитов.
В лимфоцитарном ряду на 3-е сутки после облучения абсолютное количество клеток превышало значение показателя в группе интактных животных в 2,3 раза, затем уровень клеток постепенно снижался, однако статистическая значимость различий сохранялась 21-х суток включительно (р1<0,05, р2<0,05).
Выводы
- Лейкостим проявил миелопротекторное действие в условиях экспериментального пострадиационного костномозгового синдрома у кроликов.
- Лейкостим предупреждал развитие в костном мозге экспериментальных животных пострадиационного дефицита клеток нейтрофильного, моноцитарного, лимфоцитарного рядов, в меньшей степени был эффективен в отношении эритрокариоцитарного и мегакариоцитарного рядов.
Рецензенты:
Инчина Вера Ивановна, д.м.н., профессор, заведующая кафедрой общей фармакологии с курсом клинической фармакологии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева», г. Саранск.
Микуляк Надежда Ивановна, д.м.н., профессор, заведующая кафедрой «Физиология человека» ФГБОУ ВПО «Пензенский государственный университет», г. Пенза.